LC-MS／MS法定量研究比格犬注射 liguzinediol的血浆药代动力学

朱晓雯，李 伟，文红梅，张 路，单晨啸，柴 川，范乃兵

（南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

liguzinediol是一种毒性较小［1］，具有心脏安全性，可用于治疗急性心衰的化合物。它通过影响肌浆网钙释放，增加大鼠在体和离体的心脏收缩力［2－3］，对正常大鼠及其离体心脏起到较好的正性肌力作用［4－5］。

前期对liguzinediol在大鼠体内的药代动力学、♀♂差异及药物代谢进行了研究报道［6－8］。根据一类新药研制的要求，比格犬体内的药代动力学研究对指导临床具有更为重要的意义［9－10］，本文首次研究了比格犬静注 liguzinediol后的血浆药代动力学，为liguzinediol的进一步开发和临床研究提供了必要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 liguzinediol对照品（自制，HPLC测定纯度 ＞98% ）；咖啡因（中国食品药品检定研究院，批号：171215－200507）；甲醇、甲酸为色谱纯；水为质谱纯。

1.2 仪器 AB Sciex QTRAP 5500质谱仪（美国AB公司）；LC 20A快速液相色谱仪 （日本Shimadzu公司）；VortexGenius 3涡旋混合仪（德国IKA公司）；TGL 16G离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 比格犬药代动力学试验 健康比格犬，每组6只，♀♂各半，体质量6～8 kg，由上海交通大学农学院教学实验实习场提供，动物许可证号SCXK（沪20120005）。给药前禁食12 h，并空腹抽血2 ml，动物随机编号并称重，按 1.6、3.2、6.4 mg·kg－1剂量给药，不同时间点 0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、6、8、12 h于股静脉取血约 2 ml，肝素抗凝，离心分取血浆，冷冻保存。

1.4 色谱与质谱条件 色谱条件：Shim-pack GVP-ODS保护柱（5.0 mm×2.0 mm，4.6μm）；Shim-pack XR-ODS色谱柱50 mm×2.0 mm，2.2μm）；柱温40℃；流动相为甲醇（A）－0.1% 甲酸（B），梯度洗脱：0～1 min，5%A；1～2 min，5%～75%A；2～3 min，75%A；3～3.1 min，75% ～5%A；3.1～5 min，5%A。流速0.4 ml·min－1，进样量 2μl。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；采用多反应监测模式（MRM）进行正离子检测；离子源喷雾电压5500 V；离子源温度 500℃；气帘气 40 psi；雾化气60 psi；辅助加热气 60 psi；经优化后，liguzinediol和咖啡因的参数：DP、EP、CE、CXP分别为51、10、27、14 V和 146、10、31、12 V。liguzinediol和咖啡因的检测离子分别为 m／z 169.2→122.2和 m／z 195.2→110.2。

1.5 对照品溶液的配制 取 liguzinediol对照品10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每ml含liguzinediol为1 mg的储备液。取咖啡因对照品适量，精密称定，加甲醇制成每ml含10μg的咖啡因内标溶液。

1.6 血浆样品处理 取血浆100μl，加入内标（咖啡因10 mg·L－1）100μl，混匀，再加入甲醇 1.8 ml，涡旋震荡 3 min，12 000 r·min－1离心 5 min。吸取上清液 1 ml，过 0.22μm微孔滤膜，滤液进样。

1.7 方法学考察 按药代动力学研究的相关要求，考察专属性、线性范围、检测限、提取回收率和方法回收率、日内精密度和日间精密度、样品稳定性、基质效应。

2 结果

2.1 方法学考察 在上述条件下进行检测，liguzinediol和咖啡因的保留时间分别为2.29和2.78 min左右，峰形对称，达基线分离，空白血浆中无内源性物质的干扰，专属性好。

liguzinediol在 5～1×104μg·L－1浓度范围内呈现良好的线性关系，最低检测限为0.02μg·L－1。

配制质量浓度为5、50、500及 5 000μg·L－1的血浆质控样品，按“血浆样品处理”项下方法操作，进行提取回收率、方法回收率、日内精密度、日间精密度以及基质效应等试验，结果见Tab 1，均符合生物样品的检测要求。

取上述4种浓度的质控样品，分别考察反复冻融3次，室温保存24 h，以及冷冻保存1个月的样品稳定性，其RSD不超过8.0%，表明liguzinediol血浆样品稳定。

2.2 比格犬静注药代动力学测定 采用上述LC-MS／MS方法测定静脉注射给予低、中、高3个剂量（1.6、3.2、6.4 mg·kg－1）liguzinediol后的犬血浆样品。药代动力学参数用DAS 2.0软件进行计算和处理，主要药代动力学参数见Tab 2。

Tab 1 Precision，accuracy and measured effect of the assay for liguzinediol in beagle dog plasma（¯x±s，n＝5）

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of liguzinediol in beagle dogs after intravenous administration of 1．6，3．2，6．4 mg·kg－1 liguzinediol（¯x±s，n＝6）

3 讨论

由静脉注射liguzinediol后比格犬的血浆药代动力学可见，liguzinediol在比格犬体内的清除速度较快，半衰期T12约为0.5 h，♀♂犬的药动学参数无明显差异。而前期研究［6－7］的大鼠血浆药代动力学，♀♂大鼠的T12差异明显，♂鼠的半衰期为0.3～0.5 h，而♀鼠的半衰期为1.5～2 h，♂鼠的清除速率（CL）也是♀鼠的4～5倍，是由于♀♂大鼠代谢酶差异所引起的。

分别单次静脉给予比格犬低、中、高 （1.6、3.2、6.4 mg·kg－1）3个剂量的liguzinediol后，其在动物体内的药物动力学行为具有线性特征，在实验的剂量范围内Cmax和AUC0－t均呈现剂量依赖式的增长趋势。各剂量组间的T12经统计学检验差异无显著性，说明在实验的剂量范围内药物可以在动物体内正常代谢并顺利消除，未发现明显的蓄积和饱和现象。

药效学与药代动力学实验研究表明，liguzinediol作为正性肌力药，静脉注射于动物体内起效快，作用迅速，清除完全，可为急性心衰的治疗提供实验依据。

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