硫酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸染色法在显示组织肥大细胞中的应用

丁桂龄，郑建明，刘艳芳，蒋 慧

肥大细胞含有丰富的酶系和多种生物活性物质，这些物质作为机体重要的细胞成分，广泛参与机体的免疫调节、过敏反应、肿瘤发生发展等，由此可见肥大细胞在机体病理、生理等过程中起至关重要的作用。常规HE染色不能直观地辨别肥大细胞，最常用的显示肥大细胞的特殊染色方法为甲苯胺蓝染色，但其相关试剂配制的方法有多种。为对比清晰地显示人体组织中的肥大细胞，作者选用硫酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸染色法进行组合染色，效果佳，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取2019年7月海军军医大学附属长海医院病理科存档的胰腺、十二指肠手术切除标本8例，标本均经10%中性福尔马林固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，3 μm厚切片，充分烤片。

1.2 主要试剂及配制(1)硫酸-甲苯胺蓝染液：3%硫酸100 mL，0.5%甲苯胺蓝100 mL。将3%硫酸和0.5%甲苯胺蓝按照1 ∶20比例配制成硫酸-甲苯胺蓝染液。(2)丽春红苦味酸染色液[1]：0.5%丽春红S水溶液10 mL，苦味酸饱和水溶液90 mL。

1.3 方法组织切片脱蜡至水，经硫酸-甲苯胺蓝染液作用40 min，自来水洗，丽春红苦味酸染色液滴染3 min。冷风干燥，中性树胶封固。

2 结果

肥大细胞呈圆形或椭圆形，沿血管腔散在或聚集分布，胞核较小呈浅蓝色，胞质颗粒较多，呈深蓝紫色；胶原纤维呈粉红色，粗细不均弯曲状，不规则分布(图1)。

图1 肥大细胞(红箭头)呈轮廓清晰的圆形或卵圆形，胞核呈淡蓝色，胞质颗粒呈蓝紫色；胶原纤维(蓝箭头)呈不规则且弯曲状分布的深粉红色；两者与周围组织对比明显，染色鲜明，硫酸-甲苯胺蓝-苦味酸丽春红染色

3 讨论

肥大细胞异质性是其重要生物学特征之一。现已证实在啮齿类动物中，肥大细胞可分为黏膜型肥大细胞和结缔组织型肥大细胞。黏膜型肥大细胞主要分布于呼吸道、小肠黏膜层；结缔组织型肥大细胞主要分布于皮肤结缔组织、腹腔浆膜、肌肉、血管及周围神经组织[2]，两者共同参与机体的病理、生理过程。因此，显示组织中肥大细胞的形态、数量变化和相关组织成分具有重要意义。文献报道[3]固定液的选择会影响肥大细胞的染色效果，其中采用Carnoy液固定组织后，肥大细胞的染色效果最佳。然而，本实验发现组织经常规10%中性福尔马林固定后，肥大细胞沿血管腔散在或聚集分布，呈着色鲜艳的深蓝紫色或紫红色，与周围组织对比度高，极易识别。传统方法中经甲苯胺蓝染色显示的肥大细胞，与周围组织对比度欠佳、不易辨别且染色背景深。随着技术的进步和染色方法的改进，改良甲苯胺蓝染色法和高锰酸钾硫酸甲苯胺蓝染色法相继出现，前者分化过程不易控制，后者染液配制过程相对繁琐，两种染色法显示肥大细胞的效果均不理想。本实验在原有甲苯胺蓝染色的基础上，采用硫酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸染色法进行组合染色，可直观清晰且对比鲜明地显示肥大细胞、胶原纤维、血管和红细胞。肥大细胞的特点是细胞呈圆形或椭圆形，单个或弥漫存在于结缔组织内，散在或聚集沿血管腔分布，胞核较小呈浅蓝色，胞质颗粒较多呈深蓝紫色。胶原纤维呈粗细不均且波浪状、不规则排列的粉红色。血管呈淡蓝色、稍粉染的不规则腔隙样结构，管腔内含红细胞。硫酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸染色法显示肥大细胞的原理可能为：肥大细胞粗大的嗜碱性颗粒内含有属于硫酸酯的肝素、组胺、五羟色胺等物质，这些物质具有异色性，而甲苯胺蓝染色法具有异染性，故可以将肥大细胞中的颗粒染为紫红色[4]；一定浓度的酸性染液可增强肥大细胞中胞质颗粒的异染性[5]，故在染液的配制上选择了偏酸性的3%硫酸液；采用丽春红苦味酸染液进行胶原纤维着色，可以更好地显示肥大细胞与周围其它组织的毗邻关系。染色过程中需要注意染液配制的比例，染色后的切片不能长时间经乙醇脱水和经二甲苯透明，否则已着色的组织将褪色或着色不均，建议染色完毕的组织直接经冷风干燥后封片、阅片和拍照。

综上所述，采用硫酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸进行组合染色来显示组织中的肥大细胞、血管、红细胞和胶原纤维，该方法更具实用性和可操作性，染色鲜艳，背景理想，对比度佳，效果稳定。