基于UPLC-Q-TOF／MS研究参附注射液的物质基础

何家乐，周思思，马增春，梁乾德，王宇光，谭洪玲，肖成荣，汤响林，高 月

（1.安徽医科大学研究生学院，安徽合肥 230032；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）

方剂是临床主要的用药形式，传统的中药复方都是中药材按照一定的组方原理构成，近年来有效成分的配伍正在成为复方药物研究开发的一种新的趋势，通过配伍优化从而明显提升复方中药的科技含量［1］。

参附注射液是由红参和附片的提取物制成的复方制剂，本室前期考察了参附配伍后对双酯型二萜生物碱、药物代谢酶和转运蛋白的影响［2－4］。为进一步考察组分配伍对体内过程的影响，我们运用超高效液相色谱／四级杆飞行时间质谱联用（ultra performance liquid chromatography／quadrupole time-offlight mass spectrometer，UPLC／Q-TOF-MS）技术对参附注射液的成分以及入血成分进行定性定量分析，为参附成分间相互作用研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 Wistar大鼠，6～8周龄，体质量180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心提供［动物合格证号：SCXK－（军）2007-004］。

1.1.2 试剂与材料 甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲酸（色谱纯，CNW Technologies GmbH公司）、乙腈（色谱纯，Fisher Scientific公司）、参附注射液（雅安三九药业有限责任公司，批号121220010）、人参皂苷Rd、Ro、Rc（上海源叶生物科技有限公司，批号 20120505、20120805、20120427）、人参皂苷 Rg1、Rb1、Rb2（中国药品生物制品检定所，批号110703-201027、110704-201122、111715-200802）。

1.1.3 仪器 Acquity UPLC系统和Synapt MS四级杆飞行时间质谱系统（Waters公司）、Acquity HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm I.D.，1.8μm，Waters公司）、MassLynx V4.1质谱工作站（Waters公司）、纯水仪（Millipore Simplicity）、氮气吹干仪（余姚市长江温度仪表厂，TTL-DCⅡ型）、冷冻离心机（Heraeus Labofuge 400R）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱Acquity HSS T3（100 mm ×2.1 mm I.D.，1.8μm，Waters公司），柱温45℃，进样量 5μl，流速0.45 ml·min－1；流动相 A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱条件（0→1 min：2%B；1→2 min：2%→5%B；2→3 min：5% → 20%B；3→6 min：20%→30%B；6→10 min：30%→33%B；10→13 min：33%→36%B；13→17 min：36%→40%B；17→18 min：40% → 100%B；18→19 min：100%→2%B；19→20 min：2%B）［5］。

1.2.2 质谱条件 采用电喷雾电离离子源（ESI），正离子V模式检测：m／z范围70－1000，锥孔电压40 V，毛细管电压2.9 V，脱溶剂温450℃，离子源温度100℃，锥孔气流量50 L·h－1，脱溶剂气体流速900 L·h－1，质量校正质核比 m／z 556.2771；负离子V模式检测：m／z范围 70－1200，锥孔电压为 40 kV，毛细管电压3 V，脱溶剂温为450℃，离子源温度为100℃，锥孔气流量50 L·h－1，脱溶剂气体流速为 900 L· h－1，质 量 校 正 质 核 比 为 m／z 554.2615［6］。

1.2.3 血清样品的制备 8只Wistar大鼠常规饲养数天适应环境后，随机编号，给药前禁食12 h，不禁水，按照临床剂量尾静脉注射给予参附注射液2 ml，于给药前，以及给药后 5、15、30、45、60、90、120 min，3、4、6、8、12、24、48 h眶后静脉采血 500μl，离心后分别取200μl的血清，加入800μl的甲醇，再加入100μl苦杏仁苷作为内标充分涡旋混合，13 000 r·min－1离心 10 min，取上清，吹干，200μl流动相（乙腈 ∶水＝1∶1）复溶，高速离心，取上清，即为样品，4℃保存，待测。

1.2.4 人参皂苷混合标准溶液的配制 制备材料中所述6种人参皂苷的标准曲线，通过预实验确定人参皂苷 Rd的浓度分别为 8、10、20、40、60、80μmol·L－1；人参皂苷 Rg1的浓度分别为 4、8、16、24、32、40 μmol·L－1；人参皂苷 Rb1的浓度分别为 10、20、20、40、80、120μmol·L－1；人参皂苷 Ro的浓度分别为4、10、16、24、40、60μmol·L－1；人参皂苷 Rc的浓度分别为8、10、20、40、60、100μmol·L－1；人参皂苷 Rb2的浓度分别为8、10、20、40、60、100μmol·L－1。

1.2.5 方法学考察 取空白血清180μl，加6种人参皂苷混合对照品溶液，配制成系列血清样品，按上述样品处理方法处理后进样分析，以测得的峰面积Y对血药浓度X作线性回归。同法配置低、中、高3个浓度（即加入的人参皂苷Rd的浓度分别为10、40、80μmol·L－1；人参皂苷 Rg1的浓度分别为 8、24、40μmol·L－1；人参皂苷 Rb1的浓度分别为 20、40、120μmol·L－1；人参皂苷 Ro的浓度分别为 10、24、60μmol·L－1；人参皂苷 Rc的浓度分别为 10、40、100μmol·L－1；人参皂苷Rb2的浓度分别为10、40、100μmol·L－1）的样品，按上述样品处理方法处理操作，随标准曲线同时测定，计算方法回收率、日内、日间精密度和准确度。

2 结果

2.1 方法学考察 在所选的实验条件下，血清中的内源物质并不干扰人参皂苷的测定。Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2等6种人参皂苷的最低检测限分别为0.10、0.17、0.11、0.09、0.11、0.11μg·L－1，定量下限分别是 0.54、0.30、0.99、0.51、0.96、2.02μg·L－1。该方法6种人参皂苷分别在7.93～79.3、3.38～33.8、11.1～132.8、3.82～57.33、8.62～107.76、8.62～107.76μg·L－1浓度范围内线性关系良好，回归方程分别为＾Y＝0.0187X＋0.0693（r2＝0.9934）、＾Y＝0.0399X＋0.0052（r2＝0.9984）、＾Y＝0.0294X－0.2007（r2＝0.9870）、＾Y＝0.0428X＋0.0568（r2＝0.9954）、＾Y＝0.0225X－0.0643（r2＝0.9962）、＾Y＝0.0112X＋0.0209（r2＝0.9977）。6种人参皂苷 Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2在低中高3个浓度的日内精密度、日间精密度、准确度RSD均小于10%。回收率在76.8%～96.2%之间，RSD≤9.1%，符合SFDA的相关要求。由此可见，本实验建立的LC-MS方法适用于血清中6种人参皂苷浓度的测定。

2.2 体外实验 利用LC-MS对参附注射液中的化合物进行了定性鉴别，得到参附注射液正负离子模式下的总离子流图（Fig 1、2）。采用 MassLynx4.1对正负离子模式总离子流图进行处理，并进行峰标记。在电喷雾一级谱中获得标记峰的分子量信息，结合Mass值、保留时间和EMS软件数据库对主要分子峰进行归属，确定峰化合物信息，如Tab 1、2所示，质量精确度误差均小于5ppm。

Fig 1 Total ion chromatogram of Shenfu injection in negative ion mode

2.3 体内实验 8只180～220 g健康Wistar大鼠饲养72 h适应环境后，尾静脉注射参附注射液2 ml，测得的人参皂苷平均血药浓度－时间曲线见Fig 3。主要的药物代谢动力学参数见Tab 3。

3 讨论

方剂作用的物质基础、作用机制、配伍规律及体内过程是中药研究的核心科学问题。附子的主要成分为乌头类生物碱，分为双酯型二萜类生物碱和单酯型二萜类生物碱，附子的化学成分含有多种既是有效成分又是有毒成分的成分，其中双酯型二萜类如乌头碱（aconitine）、中乌头碱（mesaconitine）、次乌头碱（hypaconitine）既表现出抗炎镇痛的药理作用，也表现出引发心率失常的毒理作用［7］。如何把握附子的“减毒存效”与“增效减毒”的问题，成为当前需要重点研究的内容之一［8］。

Fig 2 Total ion chromatogram of Shenfu injection in positive ion mode

Tab 1 Ginsenosides detected in Shenfu injection

Fig 3 Mean serum concentration-time curves of ginsenosides after intravenous injection of 2 ml Shenfu in rats（n＝8）

Tab 2 Alkaloids detected in Shenfu injection

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of ginsenosides after intravenous injection of 2 ml Shenfu in rats（¯x±s，n＝8）

对参附注射液的入血成分研究结果表明，血清中能够定量检测到的6种人参皂苷，人参皂苷Rg1、Ro的血药维持时间较短，人参皂苷 Rd、Rb1、Rb2、Rc的血药维持时间较长。观察其结构可发现人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd属于达玛烷型三萜皂苷原人参二醇型化合物，人参皂苷Rg1属于达玛烷型三萜皂苷原人参三醇型化合物，而Ro则属于齐墩果酸型皂苷，这种结构上的差异可能是造成血药维持时间差别的原因。目前对人参皂苷类成分的药代研究文献较多［9－10］，但同时检测多个人参皂苷类成分的文献较少。参附注射液的入血成分中未发现生物碱类成分，这与参附注射液中生物碱的含量较低有关，而文献曾报道参附注射粉的入血成分中含有生物碱类成分［11］。

方剂组分配伍作用可发生在化学、药代、药效等多个层次，其作用模式可在药代－药效环节产生协同、拮抗等相互作用［12］。本文在药代层次上对参附注射液体外、体内成分的分析为组分配伍研究建立了可靠的方法。

参考文献：

［1］陶 丽，范方田，陆 茵，等.中药及其组分配伍的的整合作用研究实践与进展 ［J］.中国药理学通报，2013，29（2）：153－6.

［1］Tao L，Fan F T，Lu Y，et al.Research development on the integration effect of traditional Chinese medicine and its prescriptions［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（2）：153－6.

［2］马增春，周思思，高 月，等.基于 UPLC-TOF／MS分析人参附子配伍减毒的物质基础 ［J］.药学学报，2011，46（12）：1488－92.

［2］Ma ZC，Zhou SS，Gao Y，et al.UPLC-TOF／MSbased chemical profiling approach to evaluate toxicity-attenuated chemical composition in combination of ginseng and radix aconiti praeparata［J］.Acta Pharm Sin，2011，46（12）：1488－92.

［3］李 晗，王宇光，马增春，等.基于临床用量的参附注射液对大鼠肝脏主要药物代谢酶的影响 ［J］.药学学报，2013，48（5）：728－33.

［3］Li H，Wang Y G，Ma Z C，et al.Effect of Shenfu injection on CYP450s of rat liver［J］.Acta Pharm Sin，2013，48（5）：728－33.

［4］王宇光，刘浩生，张娴勰，等.人参中皂苷成分的孕烷X受体激动特性筛选 ［J］.药学学报，2013，48（1）：144－8.

［4］Wang Y G，Liu H S，Zhang X X，et al.Screening of pregnane X receptor activation from ginsenosides［J］.Acta Pharm Sin，2013，48（1）：144－8.

［5］周思思，马增春，梁乾德，等.基于UPLC-TOF-MS分析人参麦冬配伍后人参皂苷的变化［J］.质谱学报，2013，34（2）：88－91.

［5］Zhou S S，Ma Z C，Liang Q D，et al.UPLC／Q-TOF-MS based chemical profiling approach to evaluate ginsenoside composition in combination of ginseng and radix ophiopogonis［J］.J Chin Mass Spectr Soc，2013，34（2）：88－91.

［6］周思思，马增春，高 月，等.基于UPLC／Q-TOF-MS分析附子半夏配伍相反的物质基础 ［J］.化学学报，2012，70（3）：284－90.

［6］Zhou SS，Ma Z C，Gao Y，et al.UPLC／Q-TOF-MSbased chemical profiling approach to evaluate chemical composition of augmentation toxicity in combination of radix aconiti and pinellia praeparata［J］.Acta Chim Sin，2012，70（3）：284－90.

［7］周思思，马增春，高 月，等.人参附子不同比例配伍对小鼠急性毒性的影响［J］.天津中医药，2013，30（1）：43－6.

［7］Zhou SS，Ma Z C，Gao Y，et al.Influence of radix ginseng and radix aconiti lateralis preparata in different proportion compatibility on acute toxicity in mice［J］.Tianjin J Trad Chin Med，2013，30（1）：43－6.

［8］周思思，马增春，高 月，等.基于UPLC／Q-TOF-MS分析附子煎煮过程中化学成分变化 ［J］.中西医结合学报，2012，10（8）：894－900.

［8］Zhou SS，Ma Z C，Gao Y，et al.UPLC／Q-TOF-MSbased chemical profilingapproach toevaluate the chemical constitution of radix aconiti lateralis preparata in the process of decoction［J］.J Integr Med，2012，10（8）：894－900.

［9］Chu Y，Zhang H C，Li SM，et al.Determination of ginsenoside Rc in rat plasma by LC-MS／MSand its application to a pharmacokinetic study［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，919－920（2013）：75－8.

［10］Sun D，Wang B，Shi M，et al.Pharmacokinetic，tissue distribution and excretion of ginsenoside-Rd in rodents［J］.Phytomedicine，2012，19（3－4）：369－73.

［11］Zhang F，Tang M H，Chen L J，et al.Simultaneous quantitation of aconitine， mesaconitine， hypaconitine， benzoylaconine，benzoylmesaconine and benzoylhypaconine in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and pharmacokinetics evaluation of“SHEN-FU”injectable powder［J］.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，873（2）：173－9.

［12］郝海平，郑超湳，王广基.多组分、多靶点中药整体药代动力学研究的思考与探索［J］.药学学报，2009，44（3）：270－5.

［12］Hao H P，Zheng CN，Wang G J.Thoughts and experimental exploration on pharmacokinetic study of herbal medicines with multiple-components and targets［J］.Acta Pharm Sin，2009，44（3）：270－5.