离体大鼠冠状动脉的分离培养及张力测定技术

邝素娟，邓春玉，杨 慧，饶 芳，刘晓颖，张梦珍，朱杰宁，单志新，林秋雄，杨 敏，余细勇

［广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究中心，广东省心血管病研究所，广东广州 510080］

器官培养是将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行体外培养的技术。它与整体实验相比，具有条件恒定、因素单一、便于干预的优点。与细胞培养相比，能更客观地反映细胞与细胞之间的相互联系，并避免细胞异质性和容易老化等缺点［1］。血管的器官培养因其组织结构和功能系统的完整性，为研究药物或生理活性物质的长效作用提供了有效的方法［2］。目前血管培养应用比较多的是大血管。微细动脉尤其是冠状动脉，因其血管壁平滑肌数量少、血管壁薄、管腔小，操作难度大，目前国内甚少报道。但不同部位的血管存在异质性，为建立微细动脉的培养模型，以便于对微血管的功能进行研究，本文采用大鼠冠状动脉血管环进行培养，并利用工具药检测了其舒缩功能，发现本方法简单可行，可用于进行微血管舒缩功能的研究，现将方法介绍如下。

1 材料

1.1 实验药物 5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、血栓素 A2类似物 （9，11-Dideoxy-11α，9α-epoxymethanoprostaglandin，U46619）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），均购于Sigma公司；DMEM培养基和青链霉素双抗购于Gibco BRL公司；胎牛血清购于Hyclone公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验溶液 Krebs-Henseleit（K-H）溶液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高钾 K-H溶液（含60 mmol·L－1KCl）：NaCl 63.7，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 60，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高钾无钙液：用EGTA 0.05代替高钾溶液中的CaCl2，其余成分与高钾溶液的相同。

1.3 实验动物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，体质量200～250 g，购于中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2009-0011。

1.4 实验仪器 610M型多通道血管张力测定仪（DMT公司，丹麦），PowerLab 8／30生物信号采集处理系统（AD公司，澳大利亚）；DK-8D型电热恒温水槽（上海医用恒温设备厂）。StemiDV4型体视显微镜（ZEISS公司，德国）。

2 方法

2.1 实验用品的消毒准备 手术器械、显微器械及固定心脏的硅胶脂盘用的75%乙醇浸泡消毒30 mim，然后用灭菌的去离子水冲洗数遍。PBS及其它用品高压消毒，实验室环境用紫外灯照射30 min。

2.2 冠状动脉血管环的分离及培养 取SD大鼠，采用颈椎脱臼法处死并将其固定好，先用75%酒精棉球消毒胸腹部皮肤，用大组织镊、组织剪剪开胸腹部皮肤，换另一组织镊、组织剪剪开剑突下腹部肌肉及胸廓两侧，向上翻起胸廓充分暴露心脏，眼科镊和眼科弯剪剪断胸主动脉等组织，取下心脏，放入4℃预冷的无菌PBS液中，并用PBS液冲洗3次，以洗净残余血液及血块。在冰浴条件下显微操作分离冠状动脉，以降低细胞组织的代谢，更好地维持血管的活性。操作时小心去除冠脉外周的心肌组织，避免钳夹、牵拉血管，以免损伤血管平滑肌，修剪时注意保护血管壁的完整性，不要剪破管壁而影响张力。游离出冠状动脉，并剪成1.8～2.0 mm的血管环，置于培养皿中，用DMEM-F12培养基洗1遍，再加入2 ml含10%胎牛血清、1∶100双抗的DMEM-F12培养基，在37℃、95%O2和5%CO2的通气条件下孵育24 h。

2.3 血管环的固定 将培养好的血管环穿上两根直径40 μm的不锈钢丝，平行固定于浴槽内的两个钳夹上，一个钳夹连接到螺旋测微器，用于调整脉管的周长，另一个钳夹连接到一个内置的高灵敏度张力传感器。浴槽内预先放置5 ml 37℃预温的K-H液。调节基础张力至1.5 mN，平衡60 min，期间每隔15 min换液1次，并使张力维持在1.5 mN。在加入不同药物后，血管张力的变化信号通过张力传感器，再经过数模转换器输入计算机，完成记录。实验全程浴槽内的K-H液持续通以含95%O2和5%CO2的混合气，温度控制在37℃±0.5℃。

2.4 血管功能性检测［3］首先用含 60 mmol·L－1KCl的高钾溶液刺激血管，检测血管张力的反应性。把浴槽内的K-H液换成含高钾的K-H液。高钾使冠状动脉环产生收缩反应，维持5 min待张力稳定后，以5 min末的激活张力作为100%（张力单位为mN／mm），充分冲洗（冲洗5次，每次间隔5 min）至基线，间隔30 min后，重复上述实验。前后两次高钾刺激，血管收缩的幅度相差不超过10%的用于下一步实验。

2.5 各种血管舒缩药物对培养的冠状动脉环的作用 对血管功能性检测合格的血管，采用累积给药法，向浴液中分别加入各浓度梯度的血管收缩药物5-HT、U46619、CaCl2及血管舒张药物ACh，记录血管张力的变化。

2.6 数据分析与统计学处理 以两次高钾诱发收缩张力的均值作为标准值100%，各收缩剂／高钾收缩的幅度的百分比来表示；血管舒张剂是以收缩剂诱发的最大稳定收缩幅度定为标准值100%，血管舒张／收缩的幅度以占标准值的百分比来表示，EC50表示产生50%最大效应时的药物浓度，pD2为产生最大效应的50%时激动剂摩尔浓度的负对数，pD2＝－lg（EC50）。所有数据均以¯x±s表示，采用Prism3.0软件对数据进行曲线拟合，绘制收缩及舒张曲线，并根据E-quation 1求得lgEC50和最大收缩或舒张百分比的变化值（Emax）。

3 实验结果

3．1 冠状动脉环对血管收缩剂5-HT的反应 采用累积给药法，加入5-HT，使浴槽中药物浓度分别达到0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μmol·L－1，记录血管张力的变化。结果如下图所示，培养的冠状动脉环对5-HT产生明显的浓度依赖性收缩反应，pD2为（7.02±0.58），Emax为（147.86±0.21）%，（n＝10），见 Fig 1。

Fig 1 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by 5-HT（0.003－10μmol·L－1）

3．2 冠状动脉环对血管收缩剂U46619的反应 采用累积给药法，加入U46619，使浴槽中药物浓度分别达到0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μmol·L－1，记录血管张力的变化。结果如Fig 2所示，培养的冠状动脉环对U46619产生明显的浓度依赖性收缩反应，pD2为（6.48±0.28），Emax为（130.31±0.36）%，（n＝5）。

Fig 2 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by U46619（0.01－3μmol·L－1）

Fig 3 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by CaCl2（0.01－5 mmol·L－1）

Fig 4 ACh（0．003－30μmol·L－1）induced concentration-dependent relaxation of organ cultured coronary arterial rings after the 5-HT induced contraction

3．3 冠状动脉环对CaCl2的反应 把浴槽中的K-H液换成无钙高钾溶液，待血管稳定后，采用累积给药法，加入CaCl2，使浴槽中药物浓度分别达到 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、5 mmol·L－1，记录血管张力的变化。结果如Fig 3所示，培养的冠状动脉环对CaCl2产生明显的浓度依赖性收缩反应。pD2为（3.54±0.19），Emax为（131.56±0.41）%，（n＝7）。

3．4 冠状动脉环对血管舒张剂ACh的反应 先用2μmol·L－15-HT预收缩血管环，待张力稳定后加入ACh，使浴槽中药物浓度达到 0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L－1，记录血管张力的变化。结果如Fig 4所示，5-HT预收缩的离体培养的冠状动脉环对ACh产生舒张反应，与5-HT预收缩的最大张力相比，呈浓度依赖性舒张作用，pD2为（6.99±0.23），Emax为（78.12±0.13）%，（n＝4）。

4 讨论

血管器官培养的方法有多种，有简单孵育法、格栅培养法、琼脂孔培养法等，其中最简单易行的是简单孵育法。此方法与细胞培养相比能更好地体现了血管作为一个整体的结构和功能。

本文采用简单孵育法，以颈椎脱臼法处死大鼠，分离出冠状动脉环进行体外培养。冠状动脉环培养24 h后，用两根不锈钢丝平行穿过血管腔，固定于张力测定仪的钳夹上，对血管平滑肌进行张力测定。发现血管收缩剂5-HT、U46619及CaCl2能使其产生浓度依赖性收缩，血管舒张剂ACh能使其产生浓度依赖性舒张，说明体外培养的离体冠状动脉平滑肌具有其类似于在体时的舒缩功能，此方法能用于进行血管平滑肌舒缩功能的研究。

目前国内对血管的器官培养及张力测定的研究多见于大血管如主动脉，微血管尤其是冠状动脉因其壁薄腔小，难于从组织完整分离而不损伤平滑肌，穿钢丝做张力测定时又极易损伤血管内皮，因此分离微血管做张力测定的操作难度远远大于大血管，笔者认为操作中应注意以下几点。首先，动物处死方法的选择。动物处死的方法有多种，应根据实验目的、取材部位选择不影响实验结果的方法。颈椎脱臼处死法是大、小鼠最常用的处死方法，并且可避免麻醉药对某些血管平滑肌的功能造成影响，进行血管张力实验应尽量采用此法。不管采用哪一种方法，都应遵循安乐死的原则，使实验动物短时间无痛苦地死亡。其次，在血管的分离过程中要在冰浴下进行，尽量降低组织代谢，保持血管良好的活性。游离血管时不要钳夹、牵拉血管以免损伤平滑肌。外周的脂肪组织要去除干净，因为血管外膜周围脂肪细胞可释放脂肪源性舒张因子，降低离体动脉对收缩物质的收缩反应。在穿钢丝时手要稳，尽量在血管腔中间一次穿过，避免钢丝刺到管壁平滑肌。穿血管的钢丝应保持笔直，避免折曲而损伤血管内皮。张力测定全程通以混合气，气流的速度应控制好（以3～5个气泡／秒为宜），气泡太大或太快会冲击血管环及钢丝，影响张力的测定，太小则不能为离体血管提供足够的氧气。总之，操作中保持血管平滑肌的完整性与良好活性是血管张力测定实验得以进行的前提。本研究成功建立的冠状动脉环培养及张力测定技术，为研究各种因素对微血管的功能性影响提供了新的手段。

器官培养与细胞培养相比，具有相对的完整性，能更客观地反映细胞与细胞之间的相互关系。而单个细胞的体外培养，缺乏细胞间的联系及信号的刺激，可致表面受体功能丧失和基因产物停止表达，失去其在器官水平时的形态甚至功能。例如，血管平滑肌细胞体外培养时，其表型可发生改变，可由收缩型转变为合成型。血管的器官培养则避免了这些影响，可有效弥补细胞培养的不足，在培养过程中还可于培养基中添加各种药物和体液因子，因而越来越广泛应用于血管医学的研究，尤其是研究血管平滑肌舒缩功能方面。

有文献报道［4－5］胎牛血清可减弱收缩剂诱导的体外培养大鼠肠系膜动脉平滑肌收缩与内皮依赖性舒张，而无血清的器官培养也可能导致血管出现一些功能的改变，例如收缩功能降低，受体激动剂敏感性增加以及受体表达水平的改变［6－9］。不同器官的血管分布的受体种类和数量不一，存在着异质性。本研究进行器官培养的血管是大鼠冠脉，用无血清、胎牛血清的培养是否能引起类似的结果还不太清楚。下一步实验拟研究用无血清、胎牛血清和自体血清进行血管器官培养，观察与急性分离的血管平滑肌舒缩功能的差异。

当然，器官培养属于体外培养，血管处于一种松弛不受力的状态，在此状态下血管对某些刺激的反应与生理情况下不同［10－13］，另外还缺乏在体时受到神经体液因素及血流对管壁造成的压力等因素的影响，与在体血管在生理结构和功能上并不完全相同，所以不能将离体培养血管的实验结果完全等同于在体，要客观地评价实验结果对其整体的价值。

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