脉络宁对肢体缺血／再灌注兔骨骼肌iNOS mRNA及eNOS mRNA表达的影响

王岱君，田 华

（潍坊医学院1.山东省重点学科人体解剖与组织胚胎学实验室，2.校医院，山东 潍坊 261053）

肢体缺血／再灌注损伤常见于骨外科、创伤外科、血管外科等，其后果是通过一系列病理生理反应，最终导致组织细胞的损伤乃至坏死。

国内外学者对缺血／再灌注损伤进行了长时间大量的研究，但这些研究主要集中于心、脑、肾、肝等组织器官［1－5］。脉络宁注射液是一种中药制剂，广泛应用于心脑血管病的治疗。我们前期工作发现脉络宁注射液具有保护肢体缺血／再灌注损伤的作用［6－7］。本研究在前期研究基础上，采用原位分子杂交方法检测骨骼肌诱导型一氧化氮合酶mRNA（iNOS mRNA）及内皮型一氧化氮合酶mRNA（eNOS mRNA）表达，进一步探讨脉络宁注射液对缺血／再灌注骨骼肌的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验所用动物为清洁级健康成年♂新西兰大耳白兔，共30只，体质量（2.0～2.5）kg，平均 2.2 kg，由山东大学实验动物中心提供。动物饲养环境为室温25℃，湿度40%～60%。普通饲料喂养，正常饮水。

1.2 主要试剂与仪器 脉络宁注射液由金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂生产，批号：20111030，10 ml／支；iNOS mRNA、eNOSmRNA原位分子杂交试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；TDZ5-WS离心机由长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；MetaMorph／DP10／BX41显微图像分析系统由 UIC／OLYMPUS，US／JP生产。

1.3 动物分组及模型建立 30只动物随机分为3组：假手术组（Sham），缺血／再灌注组（I／R）和脉络宁组（Mailuoning），每组10只，实验前12 h禁食。参照 Nanobashvili等［8］的方法建立兔后肢缺血／再灌注动物模型。30只动物皆自耳缘静脉注射体积分数为0.20的乌拉坦5 ml·kg－1进行麻醉，右腹股沟区小心剪毛，勿伤及皮肤，消毒，铺盖无菌洞巾，沿股血管神经走行方向切开皮肤，在解剖显微镜下分离暴露股动、静脉及股神经。缺血／再灌注组与脉络宁组动物用微血管夹夹闭股动脉，在后肢近侧端用橡皮止血带进行环扎阻断侧枝循环，以保证右后肢血液完全断流。2 h后除去血管夹及橡皮止血带，恢复血供。假手术组动物只切开腹股沟处皮肤暴露股血管，不进行夹闭股动脉及环扎后肢。

在缺血后2 h，即肢体即将恢复血供时，脉络宁组各动物静脉注射脉络宁注射液1.5 ml·kg－1，其他两组每只动物分别注射等体积的生理盐水。

1.4 取材及样品制备 再灌注后4、8、12和24 h，各组分别自术侧胫骨前肌切取约2 cm×1 cm×0.5 cm大小的骨骼肌组织，置于含有1／1 000 DEPC的0.4%多聚甲醛溶液中固定，用于iNOSmRNA、eNOSmRNA表达的检测。

1．5 骨骼肌iNOSmRNA及eNOSmRNA检测 将固定的骨骼肌标本常规脱水、浸蜡、包埋、切片。同一张载玻片上贴2张切片，分别用于检测iNOSmRNA和eNOSmRNA。原位杂交具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行，棕黄色为阳性杂交信号。显微图像分析系统对阳性染色进行分析，杂交信号的强弱以平均光密度表示。

1.6 统计学分析 所得数据以¯x±s表示，应用SPSS 16.0 for Windows统计软件包进行统计分析。多组样本均数比较行单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较用Newman-Keuls检验（q检验）。

2 结果

2．1 骨骼肌iNOS mRNA表达 假手术组在各时间点iNOSmRNA皆有少量表达，各时间点比较无差异（P＞0.05）。缺血／再灌注组iNOSmRNA表达自再灌注后2 h开始逐渐增高，至8 h达高峰，之后逐渐下降，再灌注后8 h与其他时间点比较有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），各时间点与假手术组同时间点比较均明显增高（P＜0.01或P＜0.05）。脉络宁组iNOSmRNA表达与缺血／再灌注组同时间点比较明显降低（P＜0.01或P＜0.05），与假手术组同时间点比较，除再灌注后8 h外，无统计学意义。见Tab 1。

Tab 1 Comparison of iNOS mRNA expression among groups（¯x±s，n＝10）

2．2 骨骼肌eNOS mRNA表达 假手术组在各时间点皆有eNOSmRNA表达。缺血／再灌注组在各时间点表达与假手术组同时间点比较无统计学意义（P＞0.05），脉络宁组再灌注后各时间点表达与缺血／再灌注组同时间点比较明显增高（P＜0.01或P＜0.05）。见Tab 2。

Tab 2 Comparison of eNOS mRNA expression among groups（¯x±s，n＝10）

3 讨论

本实验结果显示，肢体缺血／再灌注后骨骼肌组织内iNOSmRNA表达水平明显上调。肢体缺血／再灌注后可产生释放大量活性氧物质和炎症介质，组织内过氧化反应明显增强，从而诱生并活化骨骼肌细胞内的iNOS，而使组织中NO生成增多，介导缺血／再灌注损伤。研究结果显示，iNOSmRNA在再灌注后2 h表达明显升高，在再灌注后8 h达高峰，表明肢体缺血／再灌注后的2 h～8 h内有大量刺激因子产生。再灌注8 h后，iNOSmRNA表达水平呈现下降趋势，可能是缺血／再灌注产生释放的刺激因子在再灌注8 h后逐渐减少，或是随病程的发展，组织细胞因损伤而致基因转录下降，也可能是诱导产生的大量NO对iNOS基因表达具有负反馈调节作用。应用脉络宁后iNOS mRNA明显降低，表明脉络宁能够抑制缺血／再灌注后iNOSmRNA表达的上调，从而抑制由其诱生的高水平NO而介导组织损伤。

关于缺血／再灌注后eNOSmRNA以及蛋白的表达是增强还是降低，观点不一。多数学者认为，缺血／再灌注后内皮损伤导致内皮机能障碍，eNOS mRNA表达降低。但也有学者认为，缺血／再灌注后eNOS mRNA及蛋白的表达并无明显降低［9］，甚至可使表达增强［4］。我们的研究显示，缺血／再灌注组在各时间点eNOS mRNA表达与假手术组比较均无明显变化，这与第二种观点基本一致。应用脉络宁后eNOSmRNA的表达明显增高，可能是在缺血／再灌注过程中脉络宁能够上调eNOS mRNA表达，发挥保护内皮功能、减少黏附分子表达和阻止中性粒细胞迁移等作用。

综上所述，本实验是从基因水平对肢体缺血／再灌注后iNOSmRNA及eNOSmRNA的表达及脉络宁对其表达的影响进行了研究，结果表明缺血／再灌注过程中iNOSmRNA表达增强，脉络宁可下调再灌注过程中iNOSmRNA表达，上调eNOSmRNA表达，对肢体缺血／再灌注损伤具有保护作用。但本实验只是从mRNA的表达进行了研究，未能结合iNOS、eNOS的蛋白表达进行对比研究是其不足，今后尚需进一步探索。

参考文献：

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