左卡尼汀调控钙调神经磷酸酶表达抑制过氧化氢诱导心肌细胞凋亡作用

贾桂枝，王洪新，李 红，王翠瑶，戴红良

（辽宁医学院1.生物化学与分子生物学教研室、2.药理学教研室、3.护理学院，辽宁锦州 121001）

心肌缺血／再灌注可引起心肌细胞广泛性的坏死，促发心力衰竭，是目前世界上引起人类死亡的最重要原因之一［1］。缺血／再灌注损伤在人体会引起心肌细胞产生过多的活性氧，发生氧化应激性的损伤。H2O2等活性氧能改变心肌细胞内凋亡相关蛋白的表达水平，最终引发细胞凋亡［2］。因此，对抗由氧化应激介导的心肌细胞凋亡对于临床治疗各种缺血性心脏病意义重大。钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是目前已知唯一受钙离子／钙调素调节的蛋白磷酸酶类。在Ca2＋的激活下，对包括心肌细胞在内的多种细胞的凋亡进行调节［3－4］。有研究已证实缺血／再灌注损伤［5］、H2O2［6］及血清剥夺［7］等诱导的心肌细胞凋亡均与CaN有关。左卡尼汀是位于线粒体膜的机体内源性化合物，其主要作用是促进长链脂肪酸转运至线粒体进行β氧化，为机体供能［8］。除此之外，左卡尼汀还具有明显的抗氧化、抗凋亡活性［9－10］。其可通过缓解细胞内的Ca2＋超载，明显抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡［10］。但左卡尼汀抗H2O2致心肌细胞凋亡的机制是否与CaN有关，仍缺乏相关报道。为此，本研究利用体外培养的新生大鼠心肌细胞，探讨CaN在左卡尼汀抑制H2O2诱导心肌细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 左卡尼汀、环孢素A（cyclosporin A，CsA）、胰蛋白酶、达尔伯克必需基本培养基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）低糖培养基均购于美国Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒美国Pierce公司；cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax一抗购于美国Cell Signaling公司；CaN一抗购自美国Santa Cruz公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗购于美国Sigma公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxide，HRP）标记的二抗购于美国Santa Cruz公司。

1.2 实验动物 出生1～3 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠，♀♂不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK（辽）2003-0007。

1.3 心肌细胞培养 新生大鼠心肌细胞原代培养方法，参照文献［10］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，开胸取出心脏，用 D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm3大小的碎块，在37℃条件下，以0.8 g·L－1胰蛋白酶消化分离细胞。将消化完毕的细胞以差速贴壁法进行纯化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁融合后，换以含0.04%胎牛血清的DMEM，继续培养24 h后，将细胞分组用于实验。

1.4 实验分组 在进行细胞凋亡及细胞内cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax表达水平分析的实验中，将体外培养的SD大鼠心肌细胞随机分为正常对照组、H2O2处理组、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1） ＋H2O2组和 CsA（CaN特异性抑制剂，1μmol·L－1）＋H2O2组。在检测细胞内CaN表达的实验中将其分为正常对照组、H2O2处理组、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1）组和左卡尼汀＋H2O2组。H2O2作用强度为200μmol·L－1、12 h刺激。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，CsA于加入 H2O230 min前加入［10－11］。左卡尼汀及 CsA均维持至 H2O2作用结束。

1.5 心肌细胞凋亡测定 将经过处理的心肌细胞用1.25 g·L－1胰蛋白酶消化分离，调节细胞密度为1×109·L－1后，上流式细胞仪进行检测。具体操作方法按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书进行。

1．6 Western blot 待各组细胞处理结束后，加细胞裂解液RIPA［（1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40），0.5% 脱氧胆酸钠，1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），0.1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］提取细胞总蛋白，2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。取50μg总蛋白，以1×样品缓冲液配平上样体积，沸水煮5 min后置10%SDS-PAGE中进行电泳，待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%脱脂牛奶封闭1 h，接着加cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、CaN及 GAPDH一抗 4℃孵育过夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP标记的二抗室温孵育2 h。TBS-T洗膜后，化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色。利用美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）Image J 1.42软件对扫描的条带进行灰度分析。指定对照组蛋白表达为1，以其它组与对照组的比值反映各组的相对蛋白表达。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。数值以¯x±s表示。组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2．1 左卡尼汀及CsA对心肌细胞凋亡的影响 Fig 1结果显示，与对照组相比，H2O2处理组心肌细胞凋亡明显增加。而左卡尼汀及CsA预处理能够明显降低H2O2诱导的心肌细胞凋亡。

Fig 1 Effect of L-carnitine and CsA on H 2O2-triggered apoptosis in rat cardiac myocytes（n＝4）

2．2 左卡尼汀及CsA对心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 Fig 2结果显示，与正常组比较，H2O2处理12 h后心肌细胞内cleaved caspase-3及Bax的表达明显增加，而Bcl-2的表达却明显降低。左卡尼汀及CsA均能明显地改善H2O2诱导的上述改变。

2．3 左卡尼汀对心肌细胞内CaN表达水平的影响Fig 3结果显示，与正常组比较，H2O2处理12 h后心肌细胞内CaN表达水平明显增加。左卡尼汀能明显降低H2O2处理组心肌细胞CaN的表达。而其本身不影响CaN的表达。

3 讨论

本实验发现，左卡尼汀可通过抑制CaN的过表达以抑制氧化应激状态下心肌细胞凋亡的发生。

目前越来越多的研究提示缺血／再灌注损伤与心肌细胞凋亡有着密切的关系。尽管缺血／再灌注引起凋亡的确切机制尚未完全阐明，但可以肯定其与氧化应激损伤、钙超载有关［12－13］。H2O2可诱发心肌细胞内的钙超载，引起心肌凋亡。而左卡尼汀能够明显地缓解钙超载，抑制其细胞的凋亡［10］。CaN是细胞内钙离子执行功能的重要靶蛋白之一。最近的研究发现，CaN在H2O2诱导的心肌凋亡中发挥着重要作用［6］。本实验也发现，在CaN经其特异性抑制剂CsA阻断后，H2O2所诱发的各种凋亡相关蛋白的表达得到明显改善。具体表现为促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表达下调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达上调。心肌细胞的凋亡也明显降低。而更为重要的是，左卡尼汀在抑制心肌细胞凋亡的同时，能够明显降低H2O2诱导下CaN的过表达，提示左卡尼汀的抗凋亡活性可能与其抑制CaN的过表达有关。

关于CaN诱导心肌细胞凋亡的机制，可能涉及以下几个方面：① 与细胞凋亡信号调节激酶（ASK1）相互作用［14］；② 影响 Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用［15］；③去磷酸化（活化）转录因子活化T细胞核因子3（nuclear factor of activated T cells 3，NFATc3），使其由胞质转位于胞核，介导凋亡相关基因的表达［16］。而左卡尼汀抗心肌细胞凋亡的作用是否也涉及上述机制，仍有待于进一步的实验论证。

总之，本研究证实左卡尼汀对H2O2诱发心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，其作用机制可能与调控CaN的表达有关。该发现为左卡尼汀的临床应用提供了实验依据。

Fig 2 Effect of L-carnitine and CsA on apoptosis associated protein expression in rat cardiac myocytes（n＝3）

Fig 3 Effect of L-carnitine on H 2 O2-triggered CaN overexpression in rat cardiac myocytes（n＝3）

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