中华绒螯蟹肠道肥大细胞的组织化学研究

赵柳兰 杨筱珍 成永旭* 杨 淞

（1上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海市高校水产养殖学E－研究院，上海201306；2四川农业大学动物科技学院，雅安625014）

肥大细胞是体内组织胺的主要来源，主要分布在血管相邻的结缔组织、淋巴细胞、呼吸和胃肠道系统，以及皮肤［1］。已有研究表明肥大细胞与哺乳动物体内最常见的功能性胃肠疾病密切相关［2］，肥大细胞在溃疡肠道组出现明显脱颗粒现象［3］，而饲料中加入不同的添加剂（幼康宝和丁酸钠）能够不同程度地促进肉鸡小肠肥大细胞的数量增加［4］，因此肥大细胞的分布规律为肠道的病理机制提供了重要的依据。目前已有研究证实在多种动物体内存在肥大细胞，如鱼类，家禽，两栖以及哺乳动物等［5－10］。甲壳动物中肥大细胞的研究基本未见报道。而显示肥大细胞的染色方法较多，其中低p H值的甲苯胺蓝染色法和阿利新蓝染色法是研究动物肥大细胞2种最典型的方法［5－10］。因此本研究用这两种染色方法，探究中华绒螯蟹肥大细胞的形态和分布特点。

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）隶属于十足目（Decapoda）、方蟹科（Grapsidae）、绒螯蟹属（Eriocheir），俗称河蟹、大闸蟹，因其营养丰富，味道鲜美，广受大众喜爱而具有较高的经济价值［11］，而在中华绒螯蟹养殖的过程中，鱼粉和冰鲜野杂鱼常常被作为饲料原料或直接投喂，饲料或者野杂鱼的变质、腐败，会产生大量的生物胺。而组织胺作最毒（scombroid poisoning）的一种生物胺，常被作为检测鱼粉生产质量以及野杂鱼的新鲜度的一个标准［12－13］，同时组织胺能够造成鱼或虾胃肠道发育不良和功能障碍，甚至死亡等［14，15］。而有关组织胺对水产动物影响的研究起步较迟，其作用机理却鲜见报道。因此中华绒螯蟹肥大细胞的研究为揭示内外源组织胺作用水产动物机理提供基础资料。

材料和方法

1.材料

1.1 材料 健康中华绒螯蟹5只（125g），取中肠，肠球，后肠，中华绒螯蟹的消化道的观察分成中肠和后肠，而肠球是位于中肠和后肠之间的膨大部分［16］，用Carnoy氏液（V无水乙醇∶V氯仿∶V冰醋酸＝6∶3∶1）4℃固定2 h，石蜡包埋，5μm连续切片，进行染色，观察，Leica DM2500显微镜（Image－Pro Express 6.0软件）拍照。

1.2 主要试剂

甲苯胺蓝，盐酸，酒精，阿尔新蓝8GX，藏花红O，均购自上海国药。

2.组织化学方法

2.1 常规苏木精－伊红（HE）染色 石蜡切片常规脱蜡脱水，下行至蒸馏水，入苏木素伊红染液染30 min，1%盐酸酒精分色，100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.2 甲苯胺蓝染色（TB）［6］石蜡切片常规脱蜡，下行至蒸馏水；入甲苯胺蓝高锰酸钾染液（将7.5 g／L甲苯胺蓝溶液煮沸10 min后，逐滴入22.5 g／L高锰酸钾溶液，10 min后蒸馏水定容至100 ml，过滤备用）中染色30 s，蒸馏水洗2次×5 min，用90%酒精分色（显微镜下控制），100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。肥大细胞呈蓝色。

2.3 阿尔新兰－藏红染色（AB／SO）［6］用p H＝1.42醋酸钠－盐酸缓冲液配置0.36%阿尔新蓝8GX和0.018%藏花红O混合染液；石蜡切片常规脱蜡，脱水至蒸馏水，将切片入上述混合染液中30 min，蒸馏水洗两次2次×5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。肥大细胞有的胞浆呈蓝色，有的呈红色。

结 果

1.不同染色方法对肠道肥大细胞染色效果

采用TB和AB／SO两种染色 均能不同程度的阳性显示中华绒螯蟹肠道的肥大细胞，肠道上皮细胞肥大细胞的形态主要为椭圆形或者圆形（图1E’），具体的着色程度如下表1。TB染色较AB／SO阳性细胞较强烈，且细胞轮廓更为清晰。

表1 不同染色方法对中华绒螯蟹肠道的肥大细胞染色效果Table 1 the staining effects of mast cell in the intestinal tract of E.sinensis by TB and AB／SO staining

2.不同染色部位肥大细胞的分布规律

肠球 主要由致密嗜碱性颗粒和其肠球的边缘

少数大的嗜酸性颗粒和嗜碱性颗粒组成（图1A）。TB和AB／SO两种染色肠球均有阳性细胞，且分布基本一致（图1B和C），主要分布在肠球边缘少数存在的嗜酸性颗粒和嗜碱性颗粒中，其中AB／SO染色出现红色大颗粒（图1C→示）和蓝色小颗粒（图1C▸示）两种异质性的肥大细胞。

中肠 是分为中肠前段（图1D），中肠中段（图1 E）和中肠后段（图1F）。中肠前段主要由粘膜层，粘膜下层，肌层，外膜组成，其中粘膜层由粘膜上皮和基膜组成，基膜明显，粘膜下层不明显；外膜由细胞层和薄层的疏松结缔组织构成（图1D）中肠中段的粘膜上皮和基膜向腔内折叠形成凸起（图1G，H，I），外膜的结缔组织中存在嗜碱性的蓝色颗粒（图1G→示）和嗜酸性的红色颗粒（图1G▸示）中肠后段凸起增高增多（图1J，K，L）；

中肠经过TB和AB／SO染色，均发现肥大细胞在中肠的前段主要分布在粘膜上皮的上皮细胞（图1E，F），TB染色的粘膜层上皮细胞中胞浆着染蓝色（图1E’）；中肠中段和后段肥大细胞主要分布在基膜（图1H）及外膜结缔组织中（图1H，I，K，L），且TB染色基膜、外膜的结缔组织的颗粒（图1E、H）以及不连续的细胞层（图1K）的阳性均呈蓝色，细胞大小不一，形状各异（图1H）；而AB／SO染色外膜结缔组织中的细胞着染的颜色存在异质性：有的为红色（图1I，L▸示），有的为蓝色（图1I，L→示）。其中红色颗粒大而少，蓝色颗粒小而多。

图1 肠球和中肠的肥大细胞染色A，D，G，J为苏木精－伊红染色（HE染色）；B，E，E’，H，K为甲苯胺蓝染色（TB染色）；C，F，I为阿尔新兰－藏红染色（AB／SO染色）；其中A，B，C为肠球，D－F为中肠前段，G－I为中肠中段，J－L为中肠后段D，E，F，K：→示粘膜上皮细胞；▸示外膜的结缔组织中的颗粒；G：HE染色 →深蓝色嗜碱性颗粒，▸为红色嗜酸性颗粒物质H：→示基膜，▸示外膜的结缔组织中的颗粒；I：AB／SO染色，→蓝色颗粒，▸红色颗粒K：TB染色，→示上皮细胞，▸示外膜的不连续细胞层Fig.1 The distribution of mast cells in theintestinal bulb and midgutA，D，G，J staining with hematoxylin and eosin（HE）；B，E，E’，H，K staining with Toluidine Blue（TB）C，F，I staining with Alcian Blue－Safranin O（AB／SO）；A，B，C intestinal bulb，D～F midgut anterior segment，G～I midgut intermediate segment，J～L midgut posterior segment；D，E，F，K：→showed the mucous layer of epithelial cells；▸showed granule in the outer membrane of connective tissue G：HE staining→showed acidophilic，▸showed basophilic granulocytes；H：→showed basilemma，▸showed granule in the outer membrane of connective tissue；I：AB／SO staining→blue granules，▸red granules；K：TB staining，→showed epithelial cells，▸showed discrete cell layer in the outer membrane

图2 后肠的肥大细胞染色A，D，G为 HE染色；B，E，H，J为TB染色；C，F，I，K，L为 AB／SO染色；A，B，C：→示粘膜下层的结缔组织颗粒 D，E，F：→示固有层颗粒，▸示粘膜层的上皮细胞 G，H，I，J，K：→示肠腺，▸示上皮细胞L：→ 示肌层，▸示粘膜层表面膜Fig.2 the distribution of mast cells in thehindgutA，D，G staining with HE；B，E，H，J staining with TB；C，F，I，K，L staining with AB／SOA，B，C：→granules in the submucosa of connective tissue；D，E，F：→granules in the lamina propria；▸showed the mucous layer of epithelial cells；→G，H，I，J，K：→hindgut gland；▸epithelial cells；L→muscular layer，▸surface of mucous layer

后肠，皱襞少而大，形成嵴，外膜发达（图2AF）；后段皱襞小而多，其粘膜下层的结缔组织中含有非常发达的肠腺（图2G－L）；经过TB和AB／SO染色发现肥大细胞主要分布在后肠粘膜层上皮细胞，粘膜下层的结缔组织颗粒及肠腺（图2B，C，E，F，H，I，K，L）。TB染色后，粘膜层上皮细胞，蓝色呈零星分布（图2E，H，J▸示），而固有层也偶有淡染细胞（图2E→示）；其后肠腺花瓣状细胞外缘细胞着染蓝色（图2 H，J→示）；后肠的粘膜层表面深蓝色（图2B，J）；AB／SO染色的粘膜下层颗粒呈红色（图2B→示），粘膜层的上皮细胞也偶尔有细胞着染蓝色（图2I，K▸示），固有层偶有着染（图2F→示）；其整个肠腺的深染（图2I，K→示）；粘膜层表面出现深蓝色（图2F，I，K，L▸示）；其肌肉层中，出现一层红色的细胞（图2L：→示）。

讨 论

肥大细胞是体内组织胺的主要来源，是一群独特的细胞，起源于骨髓细胞，其主要分布在血管相邻的结缔组织、淋巴组织、呼吸和胃肠道系统，以及皮肤［1］。目前已有研究证实在多种动物体内存在肥大细胞，如鱼类，家禽，两栖以及哺乳动物等等［5－10］。甲壳动物中肥大细胞的研究基本未见报道。而显示肥大细胞的染色方法较多，其中低p H值的甲苯胺蓝染色法和阿利新蓝染色法是研究动物肥大细胞2种最典型的方法［5－10］。而本研究发现用这两种染色方法，均发现中华绒螯蟹肠球、后肠以及嵴均发现有特异性的细胞着染，说明中华绒螯蟹肠道中存在肥大细胞。用TB着染的细胞阳性较为强烈，且细胞轮廓比较清晰，形态多为圆形或椭圆形，而AB／SO着染的细胞颜色较浅，轮廓不清晰，细胞形态不一，说明肥大细胞的染色效果与染色方法相关［9，17］，且本研究表明TB更为适合对中华绒螯蟹的肠道进行着染。

而对于消化道肥大细胞的分布规律，有许多学者研究不一。本研究发现在中肠粘膜层的上皮细胞，基膜以及外膜的结缔组织颗粒着染，并且在后肠的粘膜下层的结缔组织颗粒，粘膜层的上皮细胞和肠腺中也存在肥大细胞。日本鳗鲡肠道，蟾蜍和肠道的肥大细胞的分布与本研究类似［7，8］；而 Reite发现白斑狗鱼肠道中肥大细胞在消化道中的分布更为广泛，不仅在致密层和固有层中有分布，从固有层到粘膜层的结缔组织中，以及肠道的环肌和纵肌层，甚至相连的肠系膜组织和上皮细胞中也存在［5］；且其结缔组织中颗粒有异质性染色的肥大细胞，并且该颗粒物质为嗜伊红的颗粒细胞，本研究在中肠中也发现异质性的着染的肥大细胞（图版1I，L），这可能与肥大细胞的类型相关，肥大细胞分为粘膜型和结缔组织型的，其功能分别为参与宿主的免疫反应和参与血管生成和组织代谢［18］。对于粘膜下层结缔组织中的肥大细胞颗粒物质，与姜永华报道的胃以及肠道中存在的乳糜颗粒物质形态类似，并且该研究者发现这些颗粒汞溴酚蓝深染，并呈PAS强阳性［19］，说明其含有丰富的蛋白质和糖类，而肥大细胞中组织胺的释放能够改善局部血液循环和营养物质的供应［20］，这为内外源组织胺作用水产动物机理提供基础资料。

目前对于中华绒螯蟹肠球的具体结构和功能的研究基本未见，本实验通过HE染色发现存在嗜碱性颗粒肥大细胞特异性着染。有学者猜测因其结构处于中肠和后肠过渡结构，可能兼具中肠和后肠的一些功能，即中肠的分泌与后肠的收缩重吸收［16］。而本课题组证实在肠球中存在组织胺免疫组化阳性，并且其分布与肥大细胞的着染细胞一致，暗示这些肥大细胞可能就是这些组织胺阳性的来源，与肥大细胞中存在组织胺的说法一致［1］。本研究AB／SO染色发现肌肉层中存在红色细胞，这可能支持肠道肥大细胞与消化道平滑肌的收缩有关。组织胺引起的这种收缩是否与肥大细胞释放的组织胺有关呢？至于肠球究竟是否存在分泌功能，甲壳动物肥大细胞究竟与已经发现的其他动物的肥大细胞是同一类细胞，这些都不得而知，因此这些研究有待进一步的探究。

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