高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究

田 野 徐 莹 付 勤

（中国医科大学附属盛京医院脊柱关节骨科；1中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳110004）

骨关节炎是一种严重危害人类健康的关节疾病，其特点为关节软骨退变和骨赘形成，至疾病后期，经常导致病人疼痛较重和关节活动障碍，严重影响生存质量［1］。随着我国逐步步入老龄化社会，骨关节炎的发病率逐年增加。然而，到目前为止，临床上还没有发现任何药物能够从根本上抑制骨关节炎的疾病进展，抑制软骨细胞终末期成熟分化的药物仍然停留于基础性的实验研究之中［2］。

在离体软骨细胞的培养中，研究者遇到的最大难题是如何维持软骨细胞的软骨表型特征，尤其是骨关节炎软骨细胞，其本身即具有自发性终末期成熟分化的特征。在传统的低密度单层培养条件下，骨关节炎软骨细胞很快即失去其原始软骨细胞表型特征［3］，明显改变的生物学行为常使得实验研究无法进行下去。

为了使软骨细胞的表型特征维持下去，有学者尝试了各种不同的培养方法，其中高密度微团（Micromass）培养法是一种经常采用的研究方法。有关软骨细胞的Micromass培养法，最初应用于研究长骨生长板内的软骨细胞的增生、分化和退变性变化［4，5］；也有应用于类风湿性关节炎中，研究软骨细胞和成纤维细胞间相互作用的报道［6］。但是，Micromass培养法对于人骨关节炎软骨细胞分化的影响，目前还不完全清楚。

在关节软骨细胞向终末期成熟分化的过程中，成软骨因子Col 2和Aggrecan的表达逐渐减弱；而促成熟分化因子碱性磷酸酶（ALP）及 MMP－13的表达则逐渐增强。本研究拟分离人骨关节炎软骨细胞，分别进行低密度单层培养和高密度Micromass培养，比较两种培养条件下软骨细胞的细胞形态、ALP染色强度和Col 2、Aggrecan、ALP及 MMP－13等基因的表达水平，阐明人骨关节炎软骨细胞在高密度Micromass培养状态下的分化特征。

材料和方法

1.实验材料和主要试剂

骨关节炎软骨组织（来自全膝关节置换病人截骨片）；DMEM／F12培养液（Gibco公司）；标准胎牛血清（FBS，Hyclone）；链霉蛋白酶和二型胶原酶（上海艾研生物科技有限公司）；ALP染色one－step试剂（Pierce公司）；RNeasy试剂盒（Qiagen公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；SYBR Green（Applied Biosystems公司）；Col 2兔抗人单克隆抗体（santa cruz biotechnology公司）；Aggrecan兔抗人单克隆抗体（abcam公司）；ALP兔抗人单克隆抗体（santa cruz biotechnology 公司）；MMP－13 兔抗人单克隆抗体（abcam公司）；β－actin兔抗人单克隆抗体（Sigma公司）。

2.方法

2.1 细胞分离

切取膝关节置换病人截骨片表面关节软骨组织，置于30%FBS DMEM／F12培养液中，于37℃、5%CO2孵箱中孵育1 h；吸除培养液，将软骨组织切成约5 mm大小碎块，PBS冲洗1次，加入链霉蛋白酶（1 mg／ml），37℃水浴震荡1.5 h；PBS冲洗3次，加入二型胶原酶（2 mg／ml），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育过夜；通过0.7μm过滤器过滤，收集滤过液，2200 rpm离心7 min，收集沉淀，重悬细胞，分别以不同浓度将细胞种植于6孔培养板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

2.2 细胞分组培养：将细胞分为两组

低密度单层培养法为，以2.5×105／ml，将细胞均匀种植于6孔培养板中，每孔加入培养液2 ml；

高密度 Micromass培养法为，以250×105／ml浓度的细胞，每孔20μl，将细胞混悬液轻轻置于培养孔中心位置，放入孵箱中2 h后，每孔加入培养液2 ml［7］。

两组细胞均隔日换液1次，并观察细胞形态变化。于培养后第2日开始，隔日1次进行ALP染色和RT－PCR实验。

2.3 碱性磷酸酶染色

吸除细胞培养液，PBS清洗2次，于室温下以10%中性福尔马林固定细胞15 min；吸除福尔马林，PBS清洗2次，加入ALP one－step染色剂，于37℃孵育45 min；吸除染色剂，PBS清洗2次，室温下自然干燥过夜。

2.4 RNA 提取和 Real－time PCR

用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，然后稀释3倍，取1μl稀释后的c DNA进行Real－time PCR反应。特异性人类引物序列如下：Col 2：Sense：GATGATAGGTAAGGCTGTT ；Antisense：AACAGCGGAAGCTTGGCCG；Aggrecan：Sense：GTAGAATGG GGATGATTGGC，Antisense：AGTGAACGATGGACGGTTGG；ALP：Sense：CCTGACCCTCCATTTCTCTC， Antisense： ATCCTCTAGTCTCTCCTGGG； MMP－13：Sense：AAGTCCCCGTAAAGGTCCG，Antisense：AAGCCATTAAGTACAAATG ；β－actin：Sense：GCAGAGATCAGCAAGATGTG；Antisense：CGTTTCAAGTTAGGGTGTCA。反应条件为：95℃预变性15 min后，95℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45个循环，于72℃延伸阶段检测荧光产物，生成扩增曲线。在同一次反应中，各组均设3个平行重复。以 β－actin为内参基因，通过Rotor Gene分析软件进行定量分析。

3.统计学分析

全部数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验；当P＜0.05时认为有统计学意义。

结 果

1.低密度单层培养条件下人骨关节炎软骨细胞的分化特

从形态学观察，人骨关节炎软骨细胞增殖缓慢，于第6d时达到70－80%细胞融合，其大部分细胞失去了软骨细胞形态的特征，而呈长梭形或长椭圆形（图1）。ALP染色显示，细胞内碱性磷酸酶活性逐渐增强，至第6日，碱性磷酸酶染色强度已达到较高程度（图2）。RT－PCR显示，软骨细胞的两个标志性因子Col 2和Aggrecan的mRNA的表达随培养时间的延长明显减弱；而促成熟分化因子ALP和MMP－13的表达则随时间明显增强（图3）。以上结果表明，在低密度单层培养条件下，人骨关节炎软骨细胞具有自发性成熟分化的特征。

2.高密度Micromass培养对人骨关节炎软骨细胞形态的影响

通过隔日一次显微镜下对细胞形态的观察，我们发现，与同一时间点低密度单层培养的软骨细胞相比，高密度Micromass培养条件下的细胞形态更加保持了软骨细胞圆形或椭圆形的形态特征；时间点越偏后，二者之间的差距越大（图1）。虽然高密度Micromass培养的细胞也随时间缓慢失去软骨细胞形态，但此种过程明显减缓。

图1 人骨关节炎软骨细胞在低密度单层和高密度Micromass培养条件 下的形态变化Fig.1 Morphology of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture

图2 人骨关节炎软骨细胞在低密度单层和高密度Micromass培养条件 下的ALP染色Fig.2 ALP staining of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture

3.高密度Micromass培养对人骨关节炎软骨细胞ALP染色的影响

Micromass培养的细胞内，ALP染色强度增长缓慢。在同一时间点，与低密度单层培养条件下的细胞相比，高密度 Micromass方法培养的细胞，ALP染色强度减低；尤其是于第6 d，低密度培养的细胞内ALP染色强度明显增强，Micromass的细胞染色强度仍然较低，只在微团周围出现少量染色增强（图2）。虽然低密度培养条件下细胞通透性高，高密度培养条件下的细胞密度较大，细胞通透性低，大体观察ALP染色强度应该较低密度的细胞高，但是在同一时间点与低密度培养条件下的细胞相比，染色强度反而较低，进一步说明，高密度Micromass培养降低细胞内ALP的活性，延缓骨关节炎软骨细胞成熟分化的进程。

4.高密度Micromass培养对人骨关节炎软骨细胞内成软骨和促成熟分化因子基因表达的影响

RT－PCR结果显示，于第4 d和第6 d，Micromass培养的软骨细胞内成软骨因子Col2和Aggrecan mRNA的表达，显著高于低密度单层培养下的细胞，二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）；而促成熟分化因子ALP和MMP－13 mRNA的表达，则显著低于低密度单层培养下的细胞，二者相比差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 人骨关节炎软骨细胞在低密度单层和高密度Micromass培养条件 下的细胞因子基因表达P＜0.05Fig.3 Marker genes expression of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture＊denotes P＜0.05

讨 论

在有关骨关节炎的体外实验中，人类关节软骨细胞经常作为研究的对象，建立为细胞模型［8，9］。但是，在常规单层培养条件下的软骨细胞具有明显的缺陷：增殖缓慢和随培养时间而成熟分化，这使得应用人关节软骨细胞作为研究对象的实验具有明显的局限性［10］。尤其是人骨关节炎软骨细胞，其增殖更加缓慢，随培养时间出现的成熟分化现象，也表现得更加显著，此种情况经常导致实验无法正常进行下去。

为了使骨关节炎软骨细胞的软骨特征能够较长时间的持续下去，我们应用高密度Micromass培养法培养细胞。这种培养方法曾经被应用于再生医学的实验当中，研究者应用软骨细胞微团探讨软骨组织的形成和再生条件［11，12］；同时也作为软骨缺损后修复的移植物，应用于临床研究［13］。

在我们的实验中，通过临床获得骨关节炎关节软骨标本，首先分离获得人骨关节炎软骨细胞，然后将细胞分别进行低密度单层培养和高密度 Micromass培养。为了说明软骨细胞的分化状态，我们仍然采用检测细胞内成软骨因子基因表达水平的方法。在软骨细胞的分化过程中，Col2和Aggrecan是两个最为重要的成软骨化因子，其在软骨细胞的增生和分化过程中发挥着关键性的作用，此二因子基因表达的增强，表明细胞具有软骨细胞分化的特征［14］。有研究表明，在骨关节炎关节软骨组织内，软骨细胞经历着与长骨生长板内的软骨细胞一样的变化，即成熟分化［15］。经研究证实，ALP是软骨细胞成熟分化的重要标志性蛋白，ALP表达的增强即表明软骨细胞具有成熟分化的趋势。另外，在骨关节炎软骨细胞中，MMP－13的表达也显著增高，故而是骨关节炎进展的又一标志性因子［16］。对于ALP和MMP－13基因和蛋白表达的抑制，则表明软骨细胞成熟分化的作用得到一定程度的抑制。

与以往的研究结果相一致［7，9］，本研究中低密度单层培养的骨关节炎软骨细胞内，Col2和Aggrecan的表达逐渐降低，而ALP和MMP－13的表达则逐渐增强，表明在常规培养条件下骨关节炎软骨细胞具有自发性终末期成熟分化的特征。为探讨高密度Micromass培养方法对于软骨细胞分化的影响，我们首先观察了两组细胞间形态的不同变化。通过倒置显微镜的观察结果，我们初步发现Micromass培养条件下的细胞形态变化较小，更接近于软骨细胞的形态特征。

为明确细胞内促成熟分化因子ALP的变化，我们对两组细胞进行了ALP染色。ALP染色结果显示，虽然Micromass培养条件下细胞密度较高，细胞通透性低，但是其在同一培养时间点与低密度培养相比，ALP染色强度却反而减低。尤其是于第6 d，两组细胞的染色强度差距出现了明显的区别。在Micromass培养条件下，细胞团周边出现了部分染色增强的区域，可能与周边部细胞密度减低，其细胞分化特征类似于单层培养条件下的细胞分化特征有关。

为了在基因水平进一步证明两种培养条件下细胞的不同分化特征，我们收集两组细胞进行了RTPCR实验。该实验表明，高密度Micromass培养条件下的软骨细胞内，成软骨因子Col2和Aggrecan的表达，强于低密度单层培养条件下的细胞；而促成熟分化因子ALP和MMP－13的表达则刚好相反，Micromass组细胞内该二因子表达显著降低。

综上所述，高密度Micromass培养条件下，骨关节炎软骨细胞可在一定时间内保留软骨细胞的分化特征，其终末期成熟分化的趋势得到一定程度的抑制。由于本实验的细胞培养时间较短，因此此种培养条件下更长时间的细胞分化状态，还有待于进一步研究。

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