HIF－2α、VEGF在子宫颈鳞癌组织中的表达及其临床意义

张丽霞 胡有长 施桥发 王美珍 曾文兴 江丽霞 王福财 刘玉琳

（1南昌大学医学院免疫教研室，江西330006；2嘉兴市妇幼保健院妇科，浙江314050；3南昌大学校医院，江西330006；4赣南医学院第一附属医院检验科，江西341000）

子宫颈癌是多基因改变，多步骤发生的一类全身性疾病，其发病机制尚未完全明确。近年来，研究发现在微缺氧微环境下，缺氧诱导因子（Hypoxiainducible factor，HIF）的表达，对肿瘤顺利完成局部微血管生成、以保障肿瘤快速增殖的营养需求至关重要。HIF是BHLH－PAS超家族成员，是由结构同源的α亚基和共同的β亚基组成的异二聚体转录因子。HIF的α亚基包括1α、2α和3α三个成员，其中缺氧诱导因子2α（HIF－2α）是1997年由 Tian等克隆发现的一种含有BHLH－PAS域的细胞因子，在血管生长、骨髓造血、能量代谢、肿瘤发生发展中起着重要作用［1］。本研究应用实时荧光定量PCR法及免疫组织化学法（Elivision法）检测宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织中HIF－2α、VEGF基因与蛋白的表达情况，探讨其在宫颈鳞癌中的表达及临床意义。

材料和方法

1.材料

1.1 实验材料与临床资料收集

收集江西省妇幼保健院肿瘤科2011年01月至2011年08月经病理学检测证实的子宫颈鳞癌64例为子宫颈癌组，年龄38－70岁，平均51.3±9.2岁。按照宫颈癌2009年International Federation of Gynecology and Obstetrics（FIGO）分期，Ⅰ期30例，Ⅱ期24例，Ⅲ－Ⅳ期10例。选取正常宫颈组织22例作为正常对照组，年龄32－60岁，平均48.2±8.7岁。所有患者切取组织标本前均未接受化疗或放疗，既往无其他恶性肿瘤病史。

1.2 试剂

DNA Marker DL2000、逆转录试剂盒Prime－ScriptTMreagent kit购自大连Ta KaRa公司，荧光染料SYBR Green real time PCR master mix－plus为日本 TOYOBO公司生产，2×Taq Plus PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司，引物由TakaRa公司合成。鼠抗人HIF－2α抗体、鼠抗人VEGF抗体为英国abcam公司生产，PBS、柠檬酸盐缓冲液、3%过氧化氢、Polymer helper、Polymer HRP Goat anti－Mouse／Rabbit IgG、二氨基联苯胺（DAB）为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，中性树胶为上海华申康复器材有限公司生产。

1.3 实验仪器与设备

Anke TDL80－2B低温高速离心机为美国Thermo公司生产，紫外分光光度仪为岛津－GL消耗品销售公司，微量加样器产自德国Eppendorf公司，7500 Real time PCR仪为美国Applied Biosystems公司产品，PCR扩增仪为新加坡Perkin Elmer公司产品，组织蜡切片机由德国Leica公司产生，光学显微镜为日本Olympus公司产品。

2.方法

2.1 总RNA提取

在超净台中取50－100 mg组织，迅速放入盛有1 ml Trizol的玻璃研磨器皿中，在冰上进行组织匀浆，研磨，至裂解液呈透明状。将匀浆液（裂解液）转至1.5 ml的EP管中，室温下静置5 min。加入0.2 ml氯仿后，盖紧EP管，反复振摇15 s，静置3 min。12000 g、4℃条件下离心15 min。吸取上层水相至另一干净的EP管，按1 ml TRIZOL／0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇约0.5 m1，充分混匀后，室温静置10 min。12000 g、4℃低温离心10 min，小心弃上清，加入1 ml无Rnase的75%乙醇洗涤，涡旋数秒后混匀，待充分溶解后，7500 g、4℃，低温离心5 min。弃上清，室温自然晾干5 min。加入35μl（30－50μl）DEPC水充分溶解RNA沉淀。将提取的RNA样品置－80℃冰箱保存，同时取少量鉴定进行紫外分光光度计鉴定RNA样品纯度和浓度。

2.2 实时荧光定量检测 HIF－2α、VEGF mRNA表达

新鲜宫颈标本离体后，立即切取组织块装入无菌去RNA酶的EP管，转存入－80℃冰箱内保存。采用Primer软件设计 HIF－2α、VEGF和β－actin上下游引物，具 体 序 列 如 下，HIF－2α：上 游 5′－CATGCGCTAGACTCCGAGAACA－3′；下游5′－GCTTTGCGAGCATCCGGTA－3′，扩 增 片 段 长 度 为 94bp。VEGF：上游：5′－GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTA－3′，下游：5＇－CACCAGGGTCTCGATTGGATG－3′，扩增片段148 bp；β－actin：上游5′－TGGCACCCAGCACAATGAA－3′； 下 游 5′ － CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3′，扩增片段长度为186 bp。以总RNA为模板，采用逆转录试剂盒，于37℃15min、85℃5 s合成cDNA。再进行PCR扩增及SYBRR Premix Ex Taq实时荧光定量分析，反应条件为95℃预变性30 s、95℃变性5 s、60℃延伸34 s，读板，40个循环。具体操作均按相应说明书进行。每次扩增均设内参基因组和目的基因组以及空白对照组。通过对每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（即ct值），按指数扩增的规律（2－△△CT）计算出组织中 HIF－2α、VEGF mRNA相对表达量。

2.3 免疫组织化学Elivision法检测 HIF－2α、VEGF蛋白表达

新鲜标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。每例蜡块分别连续切4μm厚切片3张，分别作HE染色和免疫组化染色。用已知阳性的胎盘组织标本作VEGF阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。经脱蜡、脱水及水化后，相继滴加一抗、二抗、链霉素蛋白－过氧化物酶溶液及二氨基联苯胺（DAB）溶液，显微镜下观察3－5 min，苏木素复染，中性树胶封片。结果判断：阳性物质为棕黄色颗粒，定位于胞浆，部分在胞核或包膜。分级标准：阳性细胞≤5%（－）；阳性细胞5%－25%（＋）；阳性细胞26%－50%（＋＋）；阳性细胞＞50%（＋＋＋）。结果采用双盲的方法，并由江西省妇幼保健院病理科有经验的病理学医师通过光学显微镜阅片并摄片。

3.统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行分析，对 HIF－2α、VEGF基因mRNA相对表达量等计量资料采用 表示，采用成组设计的t检验进行比较。HIF－2α、VEGF基因m RNA表达相关性用pearson相关性检验进行统计分析。对HIF－2α、VEGF蛋白在组织中的表达等级分类资料，采用χ2检验进行相关性统计分析。检验水准α＝0.05。

结 果

1.宫颈鳞癌、正常宫颈组织中 HIF－2α、VEGF mRNA的表达及其相关性分析

经SYBRR Premix Ex Taq实时荧光定量分析，子宫颈鳞癌组中 HIF－2αmRNA及VEGF mRNA表达水平分别为1.3418±0.812和4.4543±2.585，显著高于正常宫颈组的0.1375±0.087和0.9127±0.382（P＜0.01，见表1、表2）。

经pearson相关性检验分析结果表明，子宫颈癌组HIF－2α与VEGF m RNA表达存在显著相关（R＝0.778，P＜0.001，见表2，图2）。

表1 HIF－2α与VEGF m RNA在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达（±s）Table 1 HIF－2αand VEGF mRNA level in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues（±s）

表1 HIF－2α与VEGF m RNA在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达（±s）Table 1 HIF－2αand VEGF mRNA level in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues（±s）

a，compared with normal cervical tissues group，t＝11.672，P＜0.01；b，compared with normal cervical tissues group，t＝10.628，P＝0.006.

VEGF Group Case number HIF－2α Squamous Carcinoma of the Cerimages/BZ_235_756_1864_757_1871.pngvix 64 1.3418±0.812a 4.4543±2.585b Normal cervical tissue 22 0.1375±0.087 0.9127±0.382

图1 HIF－2α、VEGF m RNA在子宫颈鳞癌组与正常宫颈组织中的表达Fig.1 The mRNA levels of HIF－2αand VEGF in Squamous Carcinoma of the Cervix group and normal cervical tissues

图2 子宫颈鳞癌组HIF－2α与VEGF之间的关系Fig.2 The relationship of HIF－2αand VEGF in Squamous Cardmoma of the Cervix group

表2 病例组HIF－2α与VEGF m RNA表达pearson相关性检验分析Table 2 The pearson correlation analysis of HIF－2αand VEGF m RNA levels between Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues

表3 HIF－2α在宫颈鳞癌组织中的表达与临床病理参数Table 3 The mRNA levels of HIF－2αand VEGF and Clinical pathological parameters in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group

2.宫颈鳞癌组织中 HIF－2α、VEGF mRNA表达与临床病理参数的关系

宫颈鳞癌组织中HIF－2αmRNA表达与临床病理分期、淋巴结转移均呈显著的正相关（P＜0.05）；而与年龄无明显的相关（P＞0.05，见表3）3.HIF－2α、VEGF蛋白在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织中的表达及其相关性分析

经免疫组化检测发现，HIF－2α、VEGF蛋白阳性物质为棕黄色颗粒，定位于胞浆，部分在胞核或胞膜上。HIF－2α、VEGF在宫颈鳞癌组织中阳性率分别为93.8%（60／64）和90.6%（58／64），均显著高于正常宫颈组，且差异均有统计学意义（P＜0.01，表4，图3－11）。

表4 HIF－2α、VEGF蛋白在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达Table 4 HIF－2αand VEGF protein expression in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues

图3 HIF－2α、VEGF蛋白在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达阳性率Fig.3 The positive rates of HIF－2αand VEGF protein expression in Squamous Carcinoma of the Cervix （SCC）group and normal cervical tissues

对64例宫颈鳞癌组织中HIF－2α和VEGF蛋白表达强度评分进行等级相关分析，结果表明，HIF－2α蛋白的阳性水平与VEGF的阳性表达水平呈正相关（r＝0.514，P＜0.01）。结果见表5。

表5 HIF－2α和VEGF蛋白表达的相关性分析Table 5 The correlation analysis of HIF－2αand VEGF protein in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group

讨 论

缺氧诱导因子（hypoia－inducible factor，HIF）是实现肿瘤缺氧适应最重要的一类调节因子。HIF是由α亚基和β亚基组成的异二聚体转录因子。α亚基是其功能性和活性亚基，被O2高度调节，β亚基是结构性亚基，不受O2调节。目前已分离鉴定的α亚基有1α、2α、3α，均能与β亚基结合形成二聚体，分别组装成HIF－1蛋白、HIF－2蛋白和HIF－3蛋白。在氧浓度正常时，HIF－α易被泛素－蛋白酶降解，使其在组织或细胞内表达量维持在较低水平；当细胞氧浓度降低时，HIF－α降解过程受抑制，胞浆内HIF－α积聚增多并发生核转位，在细胞核中与β亚基结合形成有功能的二聚体，与目的基因特定系列缺氧反应元件（hypoxia－response element，HRE）结合，从而激活目的基因的转录，发挥其生物学活性。缺氧诱导因子转录因子家族能随着氧气浓度的降低而调控多种基因［2］，参与与肿瘤细胞增殖和转移细胞分化、细胞代谢及血管生成等过程［3，4］。Talks等［5］发现，HIF－2α蛋白几乎不在正常人组织和器官中表达，但可在多种肿瘤细胞，包括子宫内膜癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等癌细胞中表达。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是肿瘤刺激血管生长的主要细胞因子之一［6］。人VEGF基因位于染色体6p12－p21区，由7个内含子及8个外显子组成，长约14kb，形成5种异构体，VEGFl21、VEGFl45、VEGFl65、VEGFl89、VEGF206。VEGF 分 子 量 为 40－46k Da，两个相同亚基（分子量为20－23）通过二硫键连接构成。VEGF与受体结合后能磷酸化自身细胞内蛋白质的酪氨酸，增加钙离子内流，活化磷脂酶C，使细胞内磷酸肌醇水平升高，直接刺激内皮细胞增殖，利于血管生成，而且肿瘤细胞脱落进入血管和结缔组织基质中导致扩散。VEGF与内皮细胞内的囊泡小体结合，在细胞膜上形成“小孔”，促进生物分子的跨膜转运，增加血管渗透性，使血浆大分子外渗沉积在血管外基质中，为肿瘤细胞的生长、种植提供营养。Lebrecht等［7］检测宫颈癌患者血VEGF中发现浸润性宫颈癌患者血中VEGF水平明显升高，Lee等［8］的研究表明VEGF具有促进宫颈鳞癌血管形成的作用。

本研通过Real－time PCR和免疫组化检测发现宫颈鳞癌患者组HIF－2α与VEGF mRNA表达水平较正常宫颈组高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且m RNA检测与蛋白检测结果均显示HIF－2α与VEGF表达呈一定强度的正相关（r＝0.778，P＜0.05，r＝0.514，P＜0.01）。Kim及 Kawanaka等研究小组［9，10］也先后发现 HIF－2α在患者宫颈癌组织中高表达，且与放射治疗的敏感性有关；但本研究结果表明，在宫颈鳞癌组织中HIF－2α与VEGF mRNA表达与年龄无明显的相关（P＞0.05）；而与肿瘤的临床病理分期、淋巴结转移均有显著的正相关（P＜0.05）。也有研究认为HIF－2α更具有肿瘤组织特异性，在小细胞肺癌中，HIF－2α低表达，且 HIF－2α压抑后不影响癌细胞的存活［11］；而在非小细胞肺癌中高表达HIF－2α的病人预后差，且生存期明显缩短［12］。还有研究认为HIF－2α更易与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的增强子结合，与VEGF m RNA的表达高度相关［13］；HIF－1α对肿瘤缺氧环境中的生长调节主要通过能量保护机制，而HIF2α的促生长效应更有助于缺血组织中血管内皮细胞的增殖和血管异生［14］。此外，在对某些细胞系的研究中发现，HIF－1α和HIF－2α有特定的时间和功能的作用，HIF－1α主要介导急性缺氧适应，而 HIF－2α主要介导慢性缺氧适应［15，16］。综合分析本研究结果，我们认为HIF－2α与VEGF均参与了宫颈癌的发生过程，且HIF－2α有可能通过调控VEGF表达水平参与了子宫颈癌的发生、发展及侵袭转移，而HIF－2α与VEGF在正常宫颈组织中均表达甚微。本研究为探索子宫颈鳞癌防治方法提供了新思路及理论依据。

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