THP-1细胞系白血病干细胞的检测、分选及鉴定
2013-12-17王颖超殷楚云魏永纬马丽娜王春美盛光耀
王颖超,冯 磊,殷楚云,魏永纬,马丽娜,王春美,盛光耀
郑州大学第一附属医院儿科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州450052
△男,1970年12月生,硕士,副教授,研究方向:儿童血液与肿瘤方向,E-mail:yingchaowang152@163.com
急性白血病(acute leukemia,AL)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,发病率较高,在儿童和青少年恶性肿瘤中发病率居首位[1],其中儿童急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)治疗难度较大(除隐性早幼粒细胞白血病外),虽然目前完全缓解率显著提高[2],但耐药和复发仍然非常普遍,长期生存率更低[3]。AML 与干细胞关系非常密切,白血病患者体内存在极小一群非常特殊的细胞,即白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs),LSCs对常规的化疗药物不敏感,AML 的发生、复发均与这一小群LSCs 有关[4]。作者以人急性单核细胞白血病THP-1 细胞为研究对象,通过流式细胞术检测、分选CD34+CD38-的细胞,并进一步观察其生物学特性,为下一步深入研究LSCs 的特异表面标志分子和靶向治疗等后续工作打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物、细胞株及试剂 非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠40 只,6~8 周龄,雌雄不限,体质量约15 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。THP-1 细胞购自中科院上海细胞库研究所。碘化丙啶(PI)、阿糖胞苷(Sigma 公司,美国),青、链霉素(索莱宝公司,中国),改良型RPMI 1640 培养基、优级胎牛血清(Hyclone 公司,美国),小鼠抗人CD34-PE 单克隆抗体、小鼠抗人CD38-FITC 单克隆抗体、小鼠抗人IgG1-PE、小鼠抗人IgG1-FITC(eBioscience 公司,美国),组织RNA 提取试剂盒(Biomiga 公司,美国),MMLV 逆转录试剂盒、PCR 扩增试剂盒(Fermentas 公司,立陶宛),DNA Marker、引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。
1.2 细胞培养 THP-1 细胞用含体积分数20%胎牛血清、体积分数1%青链霉素的RPMI 1640 完全培养基,在37℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养,每隔48 h 换液传代。
1.3 LSCs 的检测及分选 取对数生长期的THP-1细胞,1 500 r/min 离心10 min,离心2 次,加PBS 制成单细胞悬液(106mL-1),加入3 只试管,分别加入以下单克隆抗体试剂:鼠抗人CD34-PE 和鼠抗人CD38-FITC,同型对照分别加入IgG1-PE、IgG1-FITC,同时设置阴性对照。充分混匀后4℃下避光染色20 min。染色完成后1 000 r/min 离心10 min,洗涤2 次,加入PBS 稀释样本至500 μL,重悬细胞,上流式细胞仪测定,采用CELLQUEST 软件分析。打开分选软件,设置左右收集的细胞群;换上偏振板,调整参数,使偏振板在最佳位置,打开左、右分选通道,使左右两条液流分开,开始分选;待收集结束,离心收集细胞。重复测量10 次。
1.4 细胞周期的检测 取分选后的LSCs组、非LSCs组单细胞悬液,离心洗涤,加入配好的PI 及透膜剂,室温下避光孵育20 min,10 g/L 多聚甲醛固定24 h 以上,上机前过滤细胞以防部分聚集成团的细胞堵管。收集10 000 个细胞,记录并分析G0/G1、S和G2/M 期细胞的比例。
1.5 ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因表达的检测采用实时荧光定量PCR 方法,根据试剂盒说明书对分选后LSCs 和非LSCs 提取总RNA,逆转录合成第一链cDNA 后-70℃保存或直接进行荧光定量PCR 反应,以GAPDH 为内参。使用ABI7500 光定量PCR 仪进行扩增。GAPDH 上游引物序列5'-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3',下游引物序列5'-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3';ABCG2:上游引物序列5'-GTCTAAGCAGGGACGAACAATC-3',下 游 引 物 序列5'-GCCAATAAGGTGAGGCTATCAA-3';ABCB1 上游引物序列5'-TGGTGTTTGGAGAAATGACAGAT-3',下游引物序列5'-GAAACCTGAATGTAAGCAGCAAC-3';Bcl-2 上游引物序列5'-GTGGATGACTGAATAC CTGAACC-3',下游引物序列5'-AGACAGCCAG GAGAAATCAAAC-3';Bax 上游引物序列5'-GGTT GTCGCCCTTTTCTACTT-3',下游引物序列5'-GT GAGGAGGCTTGAGGAGTCT-3'。反应体系反应条件:98℃预变性2 min;98℃变性10 s,55℃退火15 s,72℃延伸40 s,40 个循环;72℃再延伸8 min。
1.6 NOD/SCID 小鼠白血病模型建立 将35 只NOD/SCID 小鼠随机分成7组,每组5 只,A~C组经尾静脉分别注射104、105、106个非LSCs;D~F组分别注射103、104、105个LSCs;G组(阴性对照组)经尾静脉或腹腔注射无菌PBS,注射剂量均为0.2 mL。自接种日起每日观察小鼠成瘤情况,记录各组小鼠生存时间。
1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据。应用两独立样本的t 检验比较LSCs组、非LSCs 细胞周期及ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因水平的差异。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 LSCs 的分选 重复测量10 次,THP-1 细胞株中存在免疫表型为CD34+CD38-的LSCs,比例为(0.12±0.06)%;收集分选后LSCs 管细胞再次上流式细胞仪进行检测,细胞集中于之前的LSCs 区域,比例为(97.00±1.70)%。
2.2 LSCs 细胞和非LSCs 细胞细胞周期分析 见表1。
表1 细胞周期分析 %
2.3 LSCs 细胞和非LSCs 细胞不同基因表达水平的比较 见表2。
表2 LSCs 细胞和非LSCs 细胞不同基因表达水平的比较
2.4 不同分组小鼠成瘤情况比较 小鼠在接受不同处理后,除E组和G组各有1 只在观察过程中死亡,余均存活4 周以上。1×103数量的LSCs 可在4周后形成典型的NOD/SCID 小鼠白血病浸润模型,非LSCs 至少需要1×106才能成瘤,成瘤率远低于LSCs 移植组。LSCs组小鼠多在发病后1~2 周内死亡,平均生存时间为(31±2)d,而非LSCs组平均生存时间为(39±2)d,差异有统计学意义(t =7.124,P <0.001)。
3 讨论
LSCs 因具有自我更新、多向分化和无限增殖的能力,可能是导致白血病耐药及复发的根源[5]。然而,由于缺乏高度特异的细胞免疫表型,使得LSCs的分离纯化一直是亟待解决的难题之一。Feller等[6]报道了免疫表型为CD133+和(或)CD34+的人AML LSCs。LSCs 细胞表型可能还包括CD123[7]、CD96[8]、CLL-1[9]、CD47[10]、CD44[11]等。诸多LSCs免疫表型存在争议,但是CD34、CD38 仍作较经典的白血病起始细胞表面标志被许多研究所采用。该研究结果显示,在对数生长期的THP-1 细胞中,CD34+CD38-细胞的比例为(0.12±0.06)%。
研究[12]发现,90%以上的LSCs 处于细胞分裂周期的G0期,干细胞生长因子等一般难以把这些LSCs 从G0期活化刺激进入细胞增殖周期。该研究也发 现,LSCs G0/G1期 细 胞 比例 达(94.03±1.61)%,明显高于非LSCs,初步证实在THP-1 细胞中确有小部分细胞处于细胞周期中的静止状态,即LSCs。这些LSCs 比普通白血病细胞更能有效地抵御化疗药物的伤害,并能产生药物耐受。
ABC 转运体的高表达可以将许多抗肿瘤药物逆向转运出到细胞外,使抗肿瘤药物不能进入到细胞内积聚发挥作用,也是LSCs 耐药的主要原因之一。AML 患者中LSCs 相对于骨髓造血干细胞有更高的ABC 转运体相关基因ABCB1 和ABCG2 的表达[13]。该研究结果显示:LSCs 亚群ABCG2 和ABCB1 基因的表达水平明显高于非LSCs 亚群,亦证实了这一点。
凋亡逃逸也是造成LSCs 耐药的主要原因之一[14]。Bcl-2/Bax 比例上调在肿瘤的发生和发展中有着极为重要的意义[15-16]。该研究显示,与非LSCs比较,LSCs 亚群Bcl-2 的相对表达量增加,虽然Bax的表达在两亚群细胞中差异无统计学意义,但是,LSCs 亚群Bcl-2/Bax 比值显著升高。这一结果表明LSCs 比非LSCs 具有更强的凋亡逃逸现象,在临床上表现为对诱导凋亡药物不敏感,从而导致复发。
LSCs 不同于正常干细胞最显著的一点是具有高致瘤性,作者建立模型后发现:103的LSCs 早期(接种后3 周)即可在NOD/SCID 小鼠检测到白血病细胞。而非LSCs组至少需要106个细胞才能成瘤,而且发病时间晚,这说明LSCs 亚群侵袭性更高,具有高致瘤性。
综上所述,THP-1 细胞中存在小部分细胞,该部分细胞具有CD34+CD38-细胞免疫表型,处于静止的周期状态,高表达耐药基因和抗凋亡基因,具有干细胞的生物学特性及体内致瘤性。
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