3R4F参比卷烟主流烟气总粒相物的Ames试验*

尚平平，李 翔，聂 聪，赵 乐，孙学辉，彭 斌

中国烟草总公司郑州烟草研究院烟草化学重点试验室郑州450001

#通讯作者，男，1972年10月生，博士，研究员，研究方向:烟草化学和烟草烟气毒理学，E-mail:congnie@yahoo.com.cn

卷烟烟气是由5 000 多种化合物组成的复杂气溶胶，其中有69 种已经确定为致癌物［1］，如B［a］P［2］、二甲基亚硝胺［3］、多环芳烃［4］等。国际烟草科学研究合作中心的烟草烟气体外毒性测试工作组推荐采用中性红细胞毒性试验、体外微核试验和鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames 试验)，对卷烟主流烟气总粒相物(total particulate matter，TPM)进行一般毒性及遗传毒性的毒理学评价。Ames 试验是对受试化合物诱变作用的研究，由Ames［5］1966年建立并不断改进完善，在加与不加S9活化系统情况下，检测化合物对鼠伤寒沙门氏菌的诱变能力［6］。虽然国际烟草合作研究中心烟草烟气体外毒性测试工作组对卷烟烟气体外毒性评价给出了试验项目选择的建议，但各研究机构在进行具体试验时采用的方法却并不一致。作者对参比卷烟3R4F 进行Ames 试验，从测试菌株选择、S9浓度、预培养和预培养时间共4个方面进行探讨，旨在为应用Ames 试验评价卷烟主流烟气TPM 遗传毒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 肯塔基3R4F 参比卷烟(肯塔基大学)，成年雄性SD 大鼠(河南省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(豫)2005-0001)，鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株(军事医学科学院惠赠)。二甲基亚砜(DMSO，分析纯，Amresco公司)，注射用多氯联苯(美国Accustandard 公司)，叠氮钠(Amresco 公司)，蒽胺(A Johnson Matthey 公司)，硝基芴(东京化成工业株式会社)，上层培养基琼脂和底层培养基琼脂(郑州创生生物工程有限公司分装)，组氨酸和生物素(日本Solarbio 公司)。RM20H 转盘吸烟机(德国BORGWALDT 公司)，AL204-IC 电子分析天平(瑞士METTLER)，T25组织分散器(德国IKA 公司)，SW-CJ-2FD 超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，DK-S26恒温水浴锅(上海精宏试验设备有限公司)，3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma 公司)，Incucell222 生化培养箱(德国MMM 公司)，微量可调移液器(德国Eppendorf 公司)，全自动菌落计数仪(法国Interscience 公司)。

1.2 溶液配制

1.2.1 受试TPM 的配制 按GB/T5606.1 抽取卷烟作为试验样品，依据YC/T29-1996 标准规定的标准条件在RM20H 转盘吸烟机上，抽吸20 支3R4F参比卷烟，收集剑桥滤片上的TPM，以DMSO 萃取至10 g/L，然后分别稀释至250、500、750、1 000、1 250、2 500 和5 000 mg/L。染毒剂量分别为0、25、50、75、100、125、250 和500 μg/皿。

1.2.2 S9制备及S9混合液的配制 S9的制备:以玉米油为溶剂，配制200 g/L 的多氯联苯，按500 mg/kg 的剂量无菌注射入大鼠腹腔。5 d 后处死大鼠，取肝脏，用冰冷0.15 mol/L 的KCl 清洗肝脏，而后加入0.15 mol/L 的KCl 溶液，匀浆后4℃低温离心，分装，于－80℃保存备用。S9经无菌检查、蛋白质浓度测定(含量低于40 g/L)并经间接致癌物(蒽胺)鉴定其生物活性合格。S9混合液的制备:参考加拿大卫生部［7］《卷烟主流烟气细菌回突变试验》配制。其中每mL 体积分数10% S9混合液含:PBS 835 μL、1.65 mol/L KCl+0.4 mol/L MgCl2溶液20 μL、G-6-P 5 μL、NADP 40 μL 及S9100 μL;每mL 体积分数5% S9混合液含S950 μL，余与体积分数10% S9混合液同。

1.3 标准平板掺入试验 参考加拿大卫生部《卷烟主流烟气细菌回突变试验》［7］、OECD471《细菌回复突变试验》［6］及GB 15193.4-2003［8］，制备底层平板和顶层培养基，进行标准平板掺入试验。试验包括加S9(+S9)和不加S9(－S9)活化系统两部分，并设置自发突变组(受试物剂量为0)、溶剂(0.1 mL/皿DMSO)对照组和阳性对照组。在－S9活化系统时，TA97、TA100 和TA102 的阳性对照为10 mg/L叠氮钠，TA98 的阳性对照为40 mg/L 硝基芴;+S9活化系统时，4 菌株的阳性对照为20 mg/L 蒽胺。4菌株过夜培养后，细菌数不少于(1～2)×109mL－1。在保持45℃恒温的2.0 mL 顶层培养基中依次加入0.5 mmol/L组氨酸-生物素溶液0.2 mL、新鲜过夜培养的测试菌液0.1 mL、不同剂量的TPM 0.1 mL及体积分数10%S9混合液0.5 mL 后，低速旋转3 s左右，倾倒于底层平板上，顶层培养基均匀分布于底层平板表面后，于37℃生化培养箱中培养48 h。计数各平板菌落数，空白对照组、溶剂对照组、阳性对照组及每个剂量组均设3 个平行皿，试验重复3 次，取均值。以回突变菌落数为Y，TPM 剂量为X，得出剂量-反应关系的回归方程。

1.4 不同浓度活化系统对回变菌落数的影响 以TA98 和TA100 为测试菌株，分别采用体积分数5%和10%2 种浓度的S9混合液，进行标准平板掺入试验。剂量设置同1.3，计数各平板的回突变菌落数，并求得剂量-反应关系的回归方程。溶剂组的回突变菌落数均未超过自发回突变数的2 倍，说明所选溶剂无致突变作用，对试验结果无干扰;剂量组回突变菌落数超过自发回突变数2 倍，并有剂量-反应关系的，可认为受试TPM 有致突变作用［7］。

1.5 不同预培养时间对回突变菌落数的影响 以TA98 和TA100 为测试菌株，将0.1 mL 新鲜菌液、0.1 mL 受试TPM 溶液(溶剂对照加0.1 mL DMSO)和0.5 mL S9混合液移入预冷的带盖帽无菌培养管内，混匀后，在37℃下预培养0、20、40 和60 min，加入顶层培养基，混匀倾倒于底层平板，于37℃生化培养箱中培养48 h 后，计数各组平板的回突变菌落数。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行处理，采用t 检验比较不同处理方法下剂量-反应关系回归系数的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TPM 对沙门氏菌的致突变能力 TA98 和TA100 在S9存在时的阳性回突变情况见图1。不同剂量TPM 对沙门氏4 菌株诱发的回突变菌落数见表1。TPM 在1 000 mg/L 时，在+S9的情况下，回突变菌落数为自发突变数的2 倍以上，而且在试验剂量范围内显示有剂量-反应关系，说明卷烟主流烟气TPM对TA98 显示有致突变作用;无论S9活化系统存在与否，TPM 对其他3 种菌株均无致突变作用，表明TA98对卷烟主流烟气TPM 较为敏感。4 菌株的诊断性诱变剂(阳性对照)均显示阳性反应，说明S9及试验操作可靠。对TA100 和TA102 在+S9情况下的剂量-反应关系进行线性回归分析，回归方程分别为^Y =147.60 +0.18X 和^Y =269.81 +0.12X，回归系数经t 检验分析后，t =2.180，P =0.047，表明TA100 与TA102 的剂量-反应关系差异有统计学意义，同时TA100 的回归系数大于TA102 的回归系数，表明在剂量范围内TA100 比TA102 的回突变能力强。

2.2 不同浓度S9混合液的活化能力比较 37℃培养48 h 后，TPM 各剂量组的测试菌株菌苔背景良好。由表2可知，不同浓度S9作用，TPM 均对TA98显示有致突变作用。经t 检验分析后，体积分数分别为5%和10% S9活化系统下，TA98 和TA100 的剂量-反应关系回归系数差异无统计学意义，说明TA98 和TA100 在5%和10% S9活化系统下的剂量-反应关系无差异。

2.3 不同预培养时间对回变菌落数的影响 对TPM 进行不同预培养时间的Ames 试验后，结果见表3、4。20、40 和60 min 预培养时间下剂量-反应关系的回归系数与未预培养差异均无统计学意义。而预培养20 min 的TPM 在剂量为75 μg/皿时，已显示有对TA98 的致突变作用，而且对于TA98 和TA100，仅有预培养20 min 时的剂量-反应关系回归系数的数值大于未预培养。

表1 不同剂量TPM 对沙门氏4 种菌株诱发的回突变菌落数(n=3)个/皿

表2 不同浓度S9 作用后TPM 对TA98 和TA100 致突变情况(n=3)个/皿

表3 不同预培养时间下TPM 对TA98 的致突变情况(n=3)个/皿

表4 不同预培养时间下TPM 对TA100 的致突变情况(n=3)个/皿

3 讨论

卷烟主流烟气中含有B［a］P、4-氨基联苯、多环芳烃等多种改变机体遗传物质的有害成分，而这些有害成分之间可能存在相互作用，因此研究单一有害成分的毒性作用是不具有代表性的。该研究采用3R4F 参比卷烟主流烟气的TPM 作为受试物，通过Ames 试验来判断卷烟烟气的致基因突变能力。Ames 试验从核酸水平研究化学物的毒性作用，具有快速、有效、经济的特点，其敏感度和特异度为80%～90%［9］，是目前国际上普遍采用的检测环境中大量潜在致癌物通用的初筛方法之一［10］。

TA97 和TA98 可检出移码突变，TA100 和TA102 可检出碱基置换和移码突变［7］。该试验结果显示，在S9存在下，TA98 和TA100 两种菌株对TPM相对比较敏感，与1995年Steele 等［11］的报道一致，并且TA98 和TA100 的组合同样能检测出移码突变和碱基置换，因此，在研究卷烟烟气TPM 的致突变能力时，可采用这两种菌株进行。由于不同诱变剂所需S9的浓度不同，在进行Ames 试验时，每平板S9的含量直接关系到诱变剂的最佳诱变作用，作者采用体积分数5%和10%两种S9浓度进行活化作用比较。结果表明两者的活化效果基本一致，因此S9浓度选择以5%为佳，可以在保证试验结果有效的前提下，使Ames 试验更为简便、省时和节约。

卷烟烟气是含有大量化合物的复杂气溶胶，其中的化合物的毒性作用千差万别，该试验在标准平板掺入法的基础上增加了预培养阶段。结果发现37℃预培养20 min 后，回突变菌落数普遍增加，这是由于较高温度下孵育TPM、细菌和S9，可能提高了TPM 中某些遗传毒性物质敏感性。同时，随着预培养时间的增加，回突变菌落数增长相对缓慢，可能由于长时间的孵育，引起S9的活性降低，或是长时间接触较高浓度的TPM 出现抑菌现象，从而影响了TPM 对细菌的致突变作用。

该试验通过比较Ames 试验的不同影响因素，结果发现以TA98 和TA100 为测试菌株，体积分数为5%的S9活化系统，预培养20 min 可以有效检测3R4F 参比卷烟主流烟气TPM 的诱变作用。

［1］谢剑平.卷烟危害性评价原理与方法［M］.北京:化学工业出版社，2009.

［2］Cooper R，Lindsey A，Waller R.The presence of 3，4-benzpyrene in cigarette smoke［J］.Chemistry and Industry，1954:1418

［3］Magee PN，Barnes JM.The production of malignant hepatic tumours in the rat by feeding with dimethylnitrosamine［J］.Cancer，1956，10(1):114

［4］王连生，邹惠仙，韩朔睽.多环芳烃分析技术［M］.南京:南京大学出版社，1988.

［5］Ames BN，Mccann J，Yamasaki E.Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalianmicrosome mutagenicity test［J］.Mutat Res，1975，31(6):347

［6］Kim JS，Lee K，Lee YH，et al.Aspect ratio has no effect on genotoxicity of multi-wall carbon nanotubes［J］.Arch of Toxicol，2011，85(7):775

［7］Crooks I，Dillon DM，Scott JK，et al.The effect of long term storage on tobacco smoke particulate matter in in vitro genotoxicity and cytotoxicity assays［J］.Regul Toxicol and Pharmacol，2013，65(2):196

［8］GB15193.4-2003 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验［S］.2003.

［9］Gatehouse DG，Wilcox P，Forster R，et al.Bacterial mutation assays in basic mutagenicity tests:UKEMS recommended procedures［M］.Cambridge:Press SyndicateUniversity Cambridge，1990.

［10］陈祖辉，张湘桥.生物学短期试验［M］.北京:人民卫生出版社，1982.

［11］Steele RH，Payne VM，Fulp CW，et al.A comparison of the mutagenicity of mainstream cigarette smoke condensates from a representative sample of the U.S.cigarette market with a Kentucky reference cigarette (K1R4F)［J］.Mutat Res，1995，342(3/4):179