食管鳞状细胞癌细胞及组织中钙敏感受体基因启动子区甲基化状态检测*

景坤玉，董腾慧，郭明洲，薛乐勋

1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室 郑州450001 2)中国人民解放军总医院消化科 北京100853#通讯作者，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向:肿瘤标志物与基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其分布具有明显的地域差异性:西方国家多为腺癌，而亚洲地区多数为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［1-2］。食管癌具体的发病机制尚不十分明确，早期症状不典型，多数患者错过了最佳治疗时期。因此，筛选针对食管癌的早期诊断标志物是改善患者生存质量与预后的关键。抑癌基因的表观遗传学改变，尤其是启动子区域的异常高甲基化所导致的基因沉默，在肿瘤发生发展中起重要作用。在食管癌的早期病变组织中已经检测到了多个基因的甲基化异常改变。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CASR)属G 蛋白耦联受体家族成员，定位于染色体3q13，广泛分布于甲状旁腺、肾脏、骨和肠等组织，对机体Ca2+稳态的维持起关键作用。CASR 的表达异常与多种肿瘤的发生密切相关，如甲状旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌与结肠癌等［3-4］。已有报道［5］证实其在食管组织及正常食管上皮细胞系中均有表达，但是在食管癌中甲基化状态与表达的研究尚未见报道。该研究探讨了CASR基因在食管癌中启动子区甲基化状态的改变，以期寻找食管癌潜在的早期诊断标志物与治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选用的6 株食管癌细胞系(TE8、BIC1、KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE510)及正常人外周血淋巴细胞均来自中国人民解放军总医院消化科实验室，除BIC1 为食管腺癌外，其余5 株均为ESCC 细胞系。68例食管癌组织标本取自2011年7月至2012年7月安阳市肿瘤医院手术切除新鲜标本，迅速冻于液氮罐内，后转至－80℃储存。其中男53例，女15例;年龄43～78(62.1±8.1)岁，＜60 岁27例，≥60 岁41例;肿瘤位置分别为胸上段20例，胸中段36例，胸下段12例;临床TNM分期依据1997年国际抗癌联盟(UICC)标准，Ⅰ、Ⅱ期共50例，Ⅲ、Ⅳ期共18例;有淋巴结转移24例，无淋巴结转移44例;术前未经放化疗。8例正常食管黏膜组织作为对照，取自于中国人民解放军总医院消化内镜中心非肿瘤患者活检标本。

1.2 细胞培养及5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza)体外去甲基化处理 6 株食管癌细胞株均在添加体积分数10%胎牛血清(Gbico 公司)及100 kU/L 青霉素、0.1 g/L 链霉素(山东鲁抗制药)的RPMI 1640 培养基(Gbico 公司)中培养，培养条件为37℃、体积分数5% CO2。当细胞达到培养瓶底面积70%～80% 融合时，消化收集细胞，提取DNA 及RNA。根据KYSE30、KYSE140、KYSE510 的生长状况，取部分细胞接种于75 mL 的培养瓶中过夜，向培养基中加入5-Aza(Sigma 公司)至终浓度为2 μmol/L，体外诱导去甲基化。每24 h 更换1 次培养基，96 h 后提取总RNA。

1.3 组织及细胞DNA 与总RNA 的提取 食管癌组织及细胞系的DNA 提取采用蛋白酶K(Sigma 公司)裂解，酚氯仿法抽提，乙醇沉淀后溶于TE 缓冲液。细胞系总RNA 提取采用Trizol(Invitrogen 公司)试剂，在细胞处于对数生长期时提取，紫外分光光度计［A(260nm)/A(280nm)］检测浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测核酸质量，经筛选后分别保存于－20℃(DNA)与－80℃(RNA)储存备用。

1.4 DNA 样本的亚硫酸氢盐修饰及甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)检测 取2 μg 的DNA 样本用亚硫酸氢盐处理，经DNA Wizard纯化试剂盒(Promega 公司)回收，其碱基序列中甲基化的C 不发生改变，非甲基化的C 转变为U。依据序列的不同设计针对CASR 基因启动子区的特异性甲基化引物:CASR-MF，5'-GGTTCGGGTTTTTAAG TAGC-3';CASR-MR，5'-TCAAACGTTACCTATACCG C-3';以及非甲基化特异性引物:CASR-UF，5'-TTAG GTTTGGGTTTTTAAGTAGT-3';CASR-UR，5'-TCAAA CATTACCTATACCACAAA-3'，产物大小166 bp。以修饰后DNA 样本为模板，进行PCR 扩增，检测CASR 基因启动子区的甲基化状况。MSP 反应条件为:95℃5 min;95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35个循环;72℃7 min。以体外甲基化DNA(in vitro methylated DNA，IVD)作为甲基化阳性对照，以正常人外周血淋巴细胞(normal lymphocyte，NL)DNA 作为阴性对照，以灭菌双蒸水作为空白对照。

1.5 MSP 结果判定 取MSP 扩增产物10 μL，20 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测。判定原则:若非甲基化引物CASR-U 扩增出条带，而甲基化引物CASRM 未扩增出条带，则说明未发生甲基化;若甲基化引物CASR-M 扩增出条带，而非甲基化引物CASRU 未扩增出条带，则说明发生完全甲基化;若2 种引物均扩增出条带，即说明存在部分甲基化。部分甲基化与完全甲基化均认为CASR 启动子区发生甲基化。

1.6 半定量RT-PCR 检测细胞系5-Aza 处理前后CASR mRNA 的表达取5 μg 总RNA 用cDNA 第一链合成试剂盒(Invitrogen 公司)逆转录成cDNA，稀释5 倍后取2.5 μL 为模板行RT-PCR。CASR 引物 序 列:CASR-F， 5'-CGGGGTACCTTAAGCAC CTACGGCATCTAA-3';CASR-R，5'-GCTCTAGAGT TAACGCGATCCCAAAGGGCTC-3'，产物大小480 bp。以GAPDH 作为内参，GAPDH 引物序列:GAPDH-F，5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3';GAPDH-R，5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，产物大小454 bp。以灭菌双蒸水为空白对照。CASR 扩增条件:95℃5 min;95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，38 个循环;72℃5 min。最后取10 μL 的RT-PCR 产物，20 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0 进行数据处理，ESCC 患者的年龄、性别、肿瘤位置、临床TNM 分期和淋巴结转移等病理特征与CASR 启动子区甲基化的关系采用χ2检验或校正χ2检验进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CASR 在食管癌细胞系中的甲基化状态 6株细胞系MSP 结果显示:CASR 基因启动子区在KYSE30、KYSE70、KYSE140、TE8、BIC1 中均发生甲基化，而在KYSE510 中未发生甲基化(图1)。

图1 CASR 基因启动子区在食管癌细胞系中的甲基化状态

2.2 5-Aza 去甲基化处理对CASR 在食管癌细胞系中表达的调控 半定量RT-PCR 检测结果显示，在发生甲基化的食管癌细胞系KYSE30 与KYSE140中，处理前CASR 表达缺失，而5-Aza 处理96 h 后其表达恢复;在未发生甲基化的细胞系KYSE510 中，5-Aza 处理前后表达水平无差异(图2)。

2.3 CASR 在ESCC组织中的甲基化状态及其与临床病理特征的关系

2.3.1 CASR 在ESCC组织中的甲基化状态 MSP检测结果显示，ESCC组织中48例存在甲基化，甲基化率为71%(48/68)，而正常食管黏膜组织中CASR均未检测到甲基化(0/8)(图3)。

2.3.2 CASR 的甲基化状态与ESCC 患者临床病理特征的关系 CASR 启动子区甲基化状态与ESCC患者的年龄构成、性别、肿瘤位置、肿瘤TNM 分期及淋巴结转移情况等均无关(表1)。

表1 CASR 启动子区甲基化状态与临床病理特征的关系

3 讨论

食管癌的具体发病机制尚不十分清楚，近来发现抑癌基因启动子区CpG 岛高甲基化导致的表观遗传沉默，涉及细胞周期调控、凋亡、黏附及DNA 损伤修复等多个相关基因的异常表达，可导致抗肿瘤相关信号通路的紊乱［6］，与多种疾病尤其是肿瘤的发生密切相关［7-12］。先前的研究［8，10，12-14］已发现多个在食管癌组织中频繁发生甲基化的抑癌基因:如PTK6、HIN-1、TFPI-2、SST 和XAF1 等，提示食管癌的发生发展与表观遗传学尤其是DNA 甲基化的渐进性改变密切相关。该研究通过MSP 技术分析食管癌的表观遗传修饰规律和特点，以期为寻求和发现潜在的肿瘤标志物与早期诊断策略奠定基础［15］。

CASR 基因定位于染色体3q13，是G 蛋白耦联受体家族成员，广泛分布于甲状旁腺、肾脏、心脏、肠和食管等器官，在维持机体Ca2+及其他金属离子稳态中起重要作用，其异常表达与甲状旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤的发生密切相关［3］。Hizaki 等［4］研究发现CASR 基因启动子区频繁甲基化导致其表达降低或沉默;Liu 等［16］报道维生素D 对于结肠癌的抑制作用依赖CASR 的功能，提示其可能成为食管癌早期诊断、分子靶向治疗、化疗敏感性或预后等方面重要的评价指标，可通过去甲基化药物进行表观遗传临床治疗逆转其表达。

因此，探讨食管癌组织中CASR 的甲基化改变，有助于筛选针对食管癌的早期诊断标志物，开发组织特异性的治疗新方法以及降低抗肿瘤药物的不良反应，更有效地选择应对食管癌的策略。

作者利用食管癌细胞系探讨CASR mRNA 表达与甲基化之间的关系，检测了食管正常黏膜组织与ESCC组织中CASR 启动子区CpG 岛的甲基化状态，并分析甲基化与临床病理特征的关系。结果显示5 株食管癌细胞系CASR 启动子区CpG 岛发生甲基化，KYSE30、KYSE140 中CASR 表达缺失，去甲基化药物5-Aza 处理96 h 后恢复表达;KYSE510 药物处理前后均正常表达，与甲基化状态相对应，提示在食管癌细胞系中CASR 启动子区异常高甲基化并且其表达受到甲基化的调控。68例ESCC组织中CASR 频繁发生甲基化，甲基化率为71%，8例正常食管黏膜组织中没有发生甲基化，提示CASR 甲基化具有肿瘤相关性，而排除组织特异性。结合临床病理特征进行分析发现，CASR 甲基化与ESCC 患者年龄、性别、临床TNM 分期及淋巴结转移无关，推测CASR 启动子区异常高甲基化可能是ESCC 发生的早期事件，与肿瘤的恶性程度无关。

综上所述，该研究证实CASR 在食管癌细胞系中的表达受到了启动子区甲基化的调控，其导致的表达沉默可能与食管癌的发生相关。CASR 的启动子区高甲基化是ESCC组织中频繁发生的早期事件，其甲基化率高于多数在食管癌发生发展中起重要作用的基因，可能作为食管癌前病变或ESCC 早期筛查的一个潜在标志物，对于ESCC 的防治或者预测ESCC 发生的风险具有重要意义。

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