嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体SM1生物学特征及其在感染动物模型中的疗效

张 劼，李秀娟

(1.重庆市第三人民医院老年科，重庆 400014;2.重庆医科大学附属第一医院一分院普内科，重庆 400015）

嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia，Sm)为条件致病菌，随着抗生素和免疫抑制剂的大量应用，其分离率在非发酵菌中呈上升趋势并对多种抗生素耐药。噬菌体是一类细菌病毒，能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌，从而达到抗菌作用。本研究以临床分离的Sm为指示菌，从医院污水中分离并得到相对应的噬菌体，以探讨其生物学特征及其在感染动物模型中的作用，为噬菌体应用于临床奠定基础［1］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和菌株 BABLc小鼠(SPF级，20 g)来自重庆医科大学实验动物中心。实验菌株来自重庆巿临床检验中心。

1.1.2 试剂 SDS、溶菌酶、蛋白酶 K、PEG8000、EDTA、DNA酶、RNA酶及 LB培养基购自美国Sigma公司;限制性内切酶 BamHI、EcoRI、PstI、XbaI、XhoI、BglII、AatⅡ、DraI、NheI、SacI及SaII购自加拿大Fermentas公司;通用引物27f和1492r购自大连宝生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离及宿主范围的测定 取重庆医科大学附属第一医院污水1 L，将21株Sm菌液和LB 50 ml加入污水中培养，24 h后过滤除菌。采用双层琼脂平板培养法，将10μl处理后的污水与200μl宿主菌混合，加入50℃融化的半固体LB培养基2 ml混匀，倾倒于固体LB培养基上，37℃过夜培养。次日可见单个噬斑，单个噬斑经过3次反复纯化后得到单一噬菌体［2］。21株Sm制成菌板，将分离所得的8株噬菌体(108PFU/ml)各取10μl滴在上述菌板上，37℃培养。对宿主菌具有裂解作用的噬菌体可在菌板上形成透亮的噬斑，从而得到各自噬菌体的宿主范围。

1.2.2 噬菌体SM1的电镜观察 取噬菌体悬液20μl滴于铜网上，待其自然沉淀30 min后，加1滴2%磷钨酸于铜网上，染色10 min，干燥后用透射电镜观察。

1.2.3 噬菌体SM1最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)、一步生长曲线、细菌耐受噬菌体突变率的测定 感染复数是指平均每个细菌感染噬菌体的数量，产生最多子代噬菌体的MOI为最佳 MOI［3］。为了保证每条细菌只能被1个噬菌体感染，不影响噬菌体数量的测定，采用低复数感染取MOI=0.1。噬菌体与宿主菌混合37℃ 5 min后离心弃上清，洗涤去除未吸附宿主菌的游离噬菌体，37℃振荡培养。事先设定好间隔时间点，于每个点取样100μl测定噬菌体滴度。以感染时间为横坐标，噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线［4］。将宿主菌10倍连续稀释，直至10-12。于10-6～10-12稀释管中各取样10μl测出细菌数。每个稀释度管中分别加入噬菌体液，可见各管逐渐开始变清，继续培养，菌液管又开始逐渐返浊。能返浊的最低浓度管中所含细菌数的倒数即为细菌耐受噬菌体SM1的突变率。

1.2.4 噬菌体SM1 DNA的提取及酶切分析

将单菌落接种于液体LB培养基中，6 h后加入噬菌体继续培养，离心收集上清液，加入PEG 8000冰浴、离心。在离心所得的噬菌体颗粒中加入蛋白酶K及SDS裂解噬菌体衣壳，释放出核酸，抽提蛋白质后离心收集DNA沉淀［5］。取上述噬菌体核酸溶液进行常规酶切，于1%琼脂糖凝胶中电泳90 V 1 h，根据酶切图谱鉴定其核酸类型。

1.2.5 建立Sm全身感染动物模型 挑Sm单菌落，接种于液体LB培养基中，培养至早期对数生长期，将系列稀释的Sm经腹腔注射于5组小鼠(每组n=5)，观察7 d，当其中一组小鼠全部死亡的最小剂量即为100%最低致死量(minimum lethal dose，MLD)。将死亡小鼠的肺及肝组织研磨后接种至LB培养基，若有细菌生长，用16S rRNA方法进行菌株鉴定，若鉴定仍为Sm，则说明感染动物模型建立成功。取2倍100%MLD为动物感染剂量。

1.2.6 噬菌体SM1疗效观察 取2组小鼠(每组n=5)，分别用2倍100%MLD Sm菌液经一侧腹腔注射;然后，一组小鼠立即经另一侧腹腔注射噬菌体SM1液(取最佳MOI)，另一组则注射LB培养液作为对照，观察7 d。

1.2.7 灭活噬菌体SM1疗效观察 将噬菌体SM1于80℃加热30 min，行双层琼脂板检测证实全部灭活。取5只小鼠，分别以2倍100%MLD菌液注射一侧腹腔后，立即于另一侧腹腔注射灭活噬菌体SM1。观察小鼠存活状态。

2 结果

2.1 噬菌体宿主范围测定 本研究共分离出8株裂解性噬菌体，裂解率分别为 28.6%、9.5%、52.4%、14.3%、66.7%、23.8%、19% 及4.8%;其中，噬菌体 SM1的裂解率最高，为66.7%。当噬菌体SM1与其它噬菌体混合后，其综合裂解率可达到76.2%，因此将噬菌体SM1作为进一步研究对象。

2.2 透射电镜观察噬菌体SM1 透射电镜可见噬菌体SM1是肌尾噬菌体，由多面体的头部和尾部组成。头部较大，直径约50 nm，无囊膜，尾部长约70 nm(图1)。

2.3 噬菌体SM1的最佳MOI 当MOI=10-4时，噬菌体感染宿主菌后产生的子代噬菌体滴度最高(表1)，即最佳 MOI为10-4，后续实验可根据最佳MOI进行噬菌体的扩增。

图1 噬菌体SM1电镜图片(100000×)Fig.1 Electron micrographs of phage SM1(100000×)

表1 噬菌体SM1最佳MOI的测定Table 1 Determination of optimal MOI of phage SM1

2.4 噬菌体SM1的一步生长曲线 0 min时产生的噬斑为1.2×105个，即为感染初期感染了噬菌体的宿主菌。根据该曲线，可以看出噬菌体感染宿主菌的潜伏期为15 min，爆发期为50 min，裂解量为187(图2)。

2.5 细菌对噬菌体SM1的耐受突变率 将裂解至澄清的液体培养基继续培养，培养基再度返浊，分析为耐受噬菌体的细菌生长所致。根据“终点滴定—返浊法”，再度返浊的最低浓度管中所含细菌数为1.7×109，该细菌含量的倒数为突变率。即细菌对噬菌体SM1的耐受突变率为6×10-10。

图2 噬菌体SM1的一步生长曲线Fig.2 One-step growth curve of phage SM1

2.6 噬菌体SM1核酸的限制性酶切电泳 使用限制性内切酶 BamHI、EcoRI、PstⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、BglII、AatⅡ、DraⅠ、NheⅠ、SacⅠ和SaⅡ对噬菌体核酸进行酶切，但仅EcoRI和XbaⅠ能够切开基因组。由此可见，噬菌体基因组为双链DNA，估计噬菌体SM1基因组大小约50 kb(图3)。

2.7 确定100%MLD 系列稀释的Sm菌液经腹腔注射小鼠后，1.2×106CFU ～1.5×108CFU的菌液均可导致全部小鼠死亡。取死亡小鼠肺和肝组织研磨后接种LB培养基，可见细菌生长。用16S rRNA方法鉴定该菌株仍为Sm，说明感染动物模型建立成功。因此，腹腔注射6×106CFU的Sm菌液为引起小鼠死亡的100%MLD。

2.8 噬菌体SM1疗效观察 最佳MOI时，噬菌体SM1治疗组小鼠全部存活，而对照组小鼠在48 h内全部死亡。取对照组死亡小鼠以及治疗组存活48 h及7 d小鼠的肺和肝组织送病理检查。光镜下对照组小鼠肺组织广泛肺泡腔淤血，肺泡间隔毛细血管充血扩张(图4A1);肝组织广泛肝血窦充血，汇管区炎症细胞浸润(图4B1)。而噬菌体SM1治疗组小鼠48 h及7 d的肺和肝组织结构基本正常(图4A2、3，图4B2、3)。腹腔注射2倍100%MLD Sm菌液及灭活噬菌体SM1的5只小鼠在48 h内全部死亡。

图3 噬菌体SM1基因组单酶切电泳图Fig.3 Electrophoretogram of phage SM1 DNA digested with single restriction enzymes

3 讨论

Sm是医院感染的重要病原菌之一，其耐药形势严峻，甚至到了无药可治的地步，单方面的抗菌治疗已经难以解决这一问题。而噬菌体作为一种细菌病毒具有以下优势:噬菌体一旦感染宿主菌后，随着宿主菌生长而表现为指数样增殖，仅需很小剂量就可达到治疗目的;噬菌体具有严格的宿主特异性，只针对相应的病原菌，不会引起菌群失调;噬菌体的作用机制与抗生素完全不同，不受细菌耐药性的影响;细菌不容易对噬菌体产生抗性。

图4 各组小鼠肺和肝组织HE染色结果Fig.4 Pulmonary and liver tissues in different groups

本研究以Sm为指示菌，分离出裂解谱较宽的肌尾噬菌体SM1，可形成具有典型裂解性噬菌体特征的直径约3 mm，圆形透明的噬斑。噬菌体SM1的生物学特征为:基因组为双链DNA分子，以λDNA/HindⅢ Marker为标准，推测其基因组大小约为50 kb;MOI是研究病毒感染与产出之间量效关系的一个重要生物学指标，检测最佳MOI对获得大量的噬菌体具有意义。以不同MOI的噬菌体感染宿主菌，所得子代噬菌体的产量差异很大，即存在一个最佳感染复数的问题。本实验测得噬菌体SM1对其宿主菌的最佳感染复数为10-4，对以后进行噬菌体颗粒的纯化、提取基因组、制备结构蛋白均有意义;噬菌体是非细胞型微生物，从吸附宿主菌到子代噬菌体的释放是一个爆发的过程，表现为“一步生长曲线”。这种曲线反映的是噬菌体从吸附宿主菌，到进入其中复制产生子代噬菌体，最终裂解宿主菌的过程。噬菌体SM1潜伏期(15 min)短、裂解量(187)大，能够更快速和更高效的杀灭菌主菌，因此具有较好的临床应用前景;本研究中还发现，裂解澄清的菌液在继续培养过程中再次返浊，这可能是敏感宿主菌被裂解后，由突变的耐受菌所取代的一种“菌群交替”现象。究其原因可能是实验中使用的宿主菌量太大，超过了产生耐受突变的概率。那么细菌对噬菌体突变的概率是多少?噬菌体能作为治疗制剂吗?因为噬菌体制剂的制备速度远远跟不上细菌发生耐受的速度。本研究中细菌对噬菌体SM1的突变率为6×10-10，低于细菌对抗生素的自然突变率(10-6～10-9)。说明菌株Sm的耐噬率远低于对抗生素的耐药率。细菌耐受噬菌体的原因包括吸附抑制、流产感染、限制修饰、穿入阻滞、噬菌体编码的噬菌体抵抗作用以及基因工程修饰等［6-7］。

本研究以最佳MOI的噬菌体SM1液治疗全身性Sm感染的小鼠，结果显示治疗组小鼠全部存活，病理切片上见小鼠的正常组织结构完好，表明噬菌体对于Sm感染具有良好的疗效。相反灭活噬菌体SM1治疗组小鼠在48 h内却全部死亡，说明噬菌体裂解细菌的作用并不依赖于某种非特异的免疫反应，而可能与噬菌体中裂解酶及穿孔素破坏细菌的细胞壁有关。

本研究使用的指示菌来源于临床菌株，噬菌体也是从医院污水中分离得到，对临床抗感染治疗具有实用性。噬菌体具有严格的宿主特异性，只能裂解一种或者是一株细菌，这种特性虽然可避免破坏人体内的正常菌群结构以及二重感染的发生，但也导致患者感染某种细菌后无法快速的确定此细菌的株系，也就无法选择特异性的噬菌体，限制了其在临床中的应用。因此，本研究将不同宿主谱的噬菌体混合在一起联合用药来扩大其宿主范围。本实验中单株噬菌体SM1裂解率为66.7%，联合裂解谱较宽的噬菌体后，其裂解率可达到76.2%，扩大了噬菌体的宿主范围。接下来的研究中，还需筛选更多的Sm噬菌体制成“鸡尾酒”复合制剂，拓宽噬菌体裂解谱、降低交叉耐噬率、增强协同效应以及减轻毒副反应［8］。

综上所述，噬菌体SM1具有使用剂量小、起效迅速、杀菌作用强、耐噬率低、裂解谱较宽等特点，可快速有效地治疗实验小鼠的Sm全身感染，这为我们提供了一个新的治疗途径。

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