重组人NAMPT蛋白静脉注射对正常小鼠生理生化指标及脑结构的影响

袁绮艺，张纬萍

(浙江大学医学院药理学教研室，浙江杭州 310058）

尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是哺乳动物烟酰胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)补救合成途径的限速酶［1］，NAMPT又被称为前 B细胞克隆增强因子(pre-B-cell-colony-enhancing factor，PBEF)，因为其能够促进前 B细胞的成熟［2］，同时NAMPT又是一种较新的脂肪因子，被称为visfatin［3］。

被释放至细胞外的NAMPT统称为细胞外NAMPT(eNAMPT)，部分可以进入血液循环。细胞外NAMPT除了具有催化作用外，还具有类似细胞因子的非酶作用［4-5］，介导炎症、氧化应激等反应［6-7］。近年来，大量临床研究发现，肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等代谢性疾病患者的血 NAMPT水平增高，提示NAMPT与这些疾病密切相关［8-9］。有学者发现，NAMPT可能通过增加胰岛素的释放和增加胰岛素的敏感性，从而降低血糖水平［3，10］。NAMPT亦能通过增加葡萄糖的代谢来降低血糖水平，可促进血葡萄糖转化为三酰甘油，促进三酰甘油在前脂肪细胞的积聚［3］。同时有学者发现，NAMPT在降低血糖的同时可导致腹部脂肪沉积，这可能是肥胖发生的原因之一［11］。而在肥胖状态下，脂肪组织可以合成和分泌包括NAMPT在内的多种促炎性因子作用于胰岛素敏感器官，参与胰岛素抵抗的发生与发展过程，并增加肥胖患者心血管疾病的发生率［12］。因此，一些研究者认为血NAMPT水平增高可能是这些疾病的生物标记物，然而血NAMPT增高是否能够导致血糖、血脂代谢的异常尚未见报道。

血NAMPT水平还与神经系统疾病有关，如脑胶质瘤、脑缺血患者的血NAMPT水平显著增加［13-14］。最近发现，老年小鼠血清NAMPT表达显著增加［15］，而且增加水平与小鼠的活动量成负相关;再者，小鼠脑内注射NAMPT可引起小胶质细胞激活，但激活作用与NAMPT的催化作用无关。另有研究发现，脑内注射重组NAMPT蛋白可影响大鼠和鸡的摄食量和体重［15-16］。然而，血清NAMPT长期增高是否对正常小鼠脑结构有影响，目前尚不清楚。

总之，血NAMPT的水平与代谢性疾病、部分神经系统疾病密切相关，血NAMPT在这些疾病发生发展中的作用是当前的研究热点——包括研究是否能够作为一些疾病的生物标记物，血NAMPT与这些疾病发生的因果关系如何，它是否是这些疾病发生的独立危险因素之一。因此，本研究通过多次尾静脉注射重组人NAMPT蛋白，持续增加正常小鼠血清中NAMPT水平，观察对多种生理/生化指标及神经细胞形态的影响;为鉴别NAMPT的作用与其催化有关，或者是与其非酶作用有关，同时采用了酶活性缺乏的重组人NAMPT/H247A蛋白，从而评价血 NAMPT是否有独立的致病风险。

1 材料与方法

1.1 动物 Balb/c成年健康雄性小鼠，体重25～30 g，由浙江省医学科学院提供。实验遵照国家实验动物饲养和使用指南，动物饲养在温度控制的环境(22℃ ±1℃)下，保持12 h明暗循环，自由饮食和饮水。

1.2 主要仪器 冰冻切片机(CM1900，德国Leica);普通倒置荧光显微镜(BX51，日本Olympus);低温超速离心机(HIMAC CR22型，日立公司);SDS-PAGE胶电泳转膜装置(美国BIO-RAD公司);大小鼠智能无创血压计(BP-98A，日本软隆株式会社);全自动血液生化仪(Cobas C311，美国罗氏)。

1.3 试剂 鼠抗 NeuN抗体、鼠抗 GFAP抗体、Cy3标记的山羊抗鼠IgG抗体、FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体、Cy3标记的山羊抗兔IgG抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体购自美国Chemicon公司;兔抗Iba1抗体购自美国Abcam公司;封闭用羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司;含DAPI的ProLong Gold Antifade购自美国Invitrogen;其余为国产分析纯产品。

1.4 重组人NAMPT蛋白制备及注射 重组人NAMPT野生型蛋白及酶活性缺失的重组人NAMPT/H2471突变蛋白经BL21细菌表达，镍柱纯化。重组蛋白每3天进行1次尾静脉注射，注射剂量分别为 10、30、100μg/kg，实验共进行32 d。每3天测量小鼠体重。

1.5 血压和心率的测量 采用大小鼠智能无创血压计测量小鼠血压和心率。以小鼠固定器限制小鼠的活动，将血压测量器压套套至小鼠尾部近心端处，传感器置于尾中上1/3处，传感器表面对准鼠尾腹面并固定，记录心率、收缩压、舒张压和平均动脉压。每只动物重复测3次，取平均值。

1.6 血液生化指标的测量 用摘眼球法采取小鼠血样0.8～1.0 ml。血样在室温下静置40 min，以3000 r/min低温离心10 min，取上清。采用葡萄糖氧化酶法、甘油三酯比色法和胆固醇重氮法测量血糖、总胆固醇及甘油三酯。

1.7 脑组织免疫荧光染色 小鼠麻醉后经心脏先后灌流固定，取脑后用4%多聚甲醛后固定24 h，以30%蔗糖脱水，冰冻切片厚度为30 μm，以漂片法进行免疫荧光染色。将脑片置于PBS漂洗，以10%羊血清封闭30 min后，加入鼠抗NeuN抗体(1∶200)或鼠抗GFAP抗体(1∶1000)或兔抗 Iba1抗体(1∶600)，4℃孵育过夜。PBS漂洗后，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体(1∶200)或Cy3标记的山羊抗鼠IgG抗体(1∶200)，室温孵育2 h，以 PBS漂洗后，将脑片贴至玻片，避光干燥，以含 DAPI的ProLong Gold Antifade封片剂封片，最后在荧光显微镜下观察。

1.8 甲苯胺蓝染色 30 μm厚脑片置于1%甲苯胺蓝溶液染色2 min，自来水冲洗，分别用0.5%盐酸/75%乙醇溶液分化，95%乙醇脱水2 min，无水乙醇脱水2 min，吹干后浸入二甲苯透明5 min，重复3次，用中性树胶封片。脑片在光镜下拍照分析。

1.9 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，采用Prism 5软件作One-way-ANOVA检验差异显著性。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 静脉注射重组NAMPT蛋白对正常小鼠体重的影响 在注射野生型和突变型NAMPT的1～32 d间，2种NAMPT蛋白不同剂量注射对小鼠体重均无明显影响(图1)。

图1 重组NAMPT蛋白多次静脉注射对正常小鼠体重增加的影响Fig.1 Effect of NAMPT or NAMPT/H247A intravenous multiple injection on body weight gain of normal mice

2.2 静脉注射重组NAMPT蛋白对正常小鼠血糖和血脂的影响 实验小鼠在32 d后，取血检测血糖、血总胆固醇及血甘油三酯，发现野生型NAMPT和H247A突变型NAMPT蛋白对这三项血液生化指标均无明显影响(图2A、B和C)。

2.3 静脉注射重组NAMPT蛋白对正常小鼠血压及心率的影响 实验小鼠在32 d后，采用无创检测方法对小鼠的血压和心率进行检测，发现WT NAMPT和H247A NAMPT对小鼠的心率、平均动脉压、收缩压及舒张压均无明显影响(图3A、B、C 和 D)。

图2 重组NAMPT蛋白多次静脉注射对正常小鼠血糖(A)、血总胆固醇(B)和血甘油三酯(C)的影响Fig.2 Effect of NAMPT orNAMPT/H247A intravenous multiple injection on blood glucose(A)，total cholesterol(B)and triglycerides(C)of normal mice

2.4 静脉注射重组NAMPT蛋白对正常小鼠CA1区神经元的影响 实验在32 d后，以Nissel染色和NeuN免疫组化染色检测海马CA1区神经元的形态，发现野生型NAMPT和H247A突变型NAMPT蛋白多次静脉注射对神经元的形态无明显影响(图4)。

2.5 静脉注射重组NAMPT蛋白对正常小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞激活的影响 实验在32 d后，以GFAP免疫组化染色观察星形胶质细胞，以Iba1免疫组化染色观察小胶质细胞，发现2种NAMPT对星形胶质细胞及小胶质细胞均无明显的激活作用，未见星形胶质细胞的肿大(图5A)，亦未见有圆形的、被激活的小胶质细胞(图5B)。

3 讨论

本研究结果发现，增加血NAMPT水平，对正常小鼠体重、血压、心率、血糖、总胆固醇、甘油三酯等均无明显影响，对海马CA1区神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞也无明显影响。抑制 NAMPT的催化作用，但保留其非酶作用——即采用 NAMPT/H247A突变蛋白，与NAMPT野生型蛋白的作用相同。

首先，本研究结果显示，静脉注射野生型或H247A突变型NAMPT蛋白不影响正常小鼠的血糖。2005年Fukuhara等在《Science》发表论文指出，NAMPT具有降血糖作用，而且其作用方式是通过作用在胰岛素受体实现，并指出胰岛素受体是NAMPT的作用靶点［3］。然而2年后，由于证据不充分，结果不能完全被重复，该论文被迫撤销，从而导致了对NAMPT是否作用于胰岛素的争议。近年研究认为，NAMPT可能是机体保持血糖平衡的反馈调节因子之一，NAMPT可通过增加胰岛β细胞释放胰岛素［3，10］，或者增加胰岛素的敏感性［17］，通过促进血浆葡萄糖转化为三酰甘油［3］，从而降低血糖水平。然而也有一些不同的报道否认在血管内皮细胞、巨噬细胞和胰岛β细胞中血NAMPT对胰岛素受体的作用［18-21］。另有学者认为，代谢综合征中NAMPT应该被看做一种促进胰岛素抵抗发展的前炎症因子［22］;NAMPT在II型糖尿病中的增加与肥胖和胰岛素抵抗无关［23-25］。在本研究中，由于正常小鼠本身能够分泌足够的胰岛素，同时其胰岛素受体的敏感性正常，这可能是NAMPT对正常血糖不影响的原因。

图5 重组NAMPT蛋白多次静脉注射对正常小鼠海马星形胶质细胞(A)及小胶质细胞(B)的影响Fig.5 Effect of NAMPT or NAMPT/H247A intravenous multiple injection on astrocyte(A)and microglia(B)in hippocampus of normal mice

其次，多次静脉注射野生型或H247A突变型NAMPT蛋白不影响正常小鼠的血脂水平。有文献报道，NAMPT可以促进三酰甘油在前脂肪细胞的积聚，并促进脂肪组织的分化、合成和储积［3］。在非糖尿病的白种人临床病例中发现，血NAMPT水平与高密度脂蛋白呈正相关，与甘油三酯呈负相关，这种显著的相关性可能与NAMPT具有的NAD合成酶作用存在着联系［26］，因为有研究报道，烟酸在增加血清高密度脂蛋白的同时能够减少血清中富含甘油三酯的脂蛋白［27］。本实验结果显示，实验组总胆固醇、甘油三酯略有下降趋势，但差异无统计学意义。

多次静脉注射野生型或H247A突变型NAMPT蛋白对正常小鼠的血压和心率也无明显影响。NAMPT本身并没有血管收缩或舒张作用，不参与对血管的张力调节，在年轻高血压患者血NAMPT水平与对照组相近，NAMPT的失调可能与高血压发病机制无关［28］。另外，NAMPT对血管内皮细胞正常状态下影响不明显，但在高糖环境中，NAMPT使内皮细胞寿命增加，内皮血管形成能力增强［29］。本实验结果显示，通过尾静脉注射增加血清NAMPT水平，对小鼠血压、心率没有明显影响，这进一步说明在正常小鼠，血NAMPT可能不参与血管功能的调节。

最后，经多次静脉注射野生型或H247A突变型NAMPT蛋白对正常小鼠海马CA1区神经元、小胶质细胞及星形胶质细胞均无明显的作用。有研究发现，直接在侧脑室注射重组NAMPT蛋白可引起大鼠摄食减少，体重减轻［15］，在雏鸡脑室注射重组NAMPT蛋白则增加摄食量，但不影响饮水量［16］。而我们发现，在大鼠侧脑室注射重组NAMPT蛋白，可导致小胶质细胞的激活，在原代培养大鼠平层混合神经细胞时发现，重组NAMPT蛋白也能激活小胶质细胞(未发表资料)。本实验结果显示，血清NAMPT的增加未对中枢神经功能或者神经细胞形态产生影响，主要可能是血NAMPT在正常小鼠不能通过血脑屏障。

总之，通过多次静脉注射，较长时间的增加正常小鼠血清中NAMPT或者NAMPT/H247A水平，对小鼠的生理生化指标及脑内主要神经细胞均无明显影响，提示血NAMPT的单独增高在正常个体可能不会引起代谢性疾病和神经功能障碍的发生，血NAMPT增高作为独立致病因素的风险较低。但不能排除在有代谢性疾病、神经系统疾病、老年等特殊病理生理条件下，血NAMPT增高后通过与其它分子产生相互作用，或者通过血脑屏障，从而影响疾病的发生、发展。

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