卡托普利、西地那非对右心衰竭幼鼠TGF-β1表达的影响

苏 静，冯 嵩，葛 薇，刘 娜，安金斗

郑州大学第一附属医院儿内科 郑州 450052

心力衰竭是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征，儿科常见于大型室间隔缺损、动脉导管未闭等先天性心脏病导致的右心衰竭。心脏经历了缺血缺氧、心肌肥厚、心室重塑，最终导致心力衰竭。心肌纤维化是心室重塑的重要表现之一，转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是近年来发现的心肌纤维化过程中的重要生物活性物质，同时与心肌肥厚密切相关[1]。有报道[2]血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)可降低血清TGF-β1，改善心功能。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)5抑制剂可对抗超载所致的多条心肌肥大通路的激活以改善心脏的功能[3]，其作用机制尚不十分明确。关于二者用于右心衰竭治疗的疗效是否相同及联合应用的效果如何，研究报道甚少。为此，作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1动物、试剂和仪器SD幼年大鼠78只，4周龄，体质量85～105 g，雄性，购自河南省实验动物中心。卡托普利(中美上海施宝有限公司，批号：1109031)，西地那非(辉瑞制药有限公司，批号：1183026)，野百合碱(MCT，上海惠城生物科技有限公司，批号：1109027)，ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗大鼠多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，德国Lecia显微照相系统，Biosens数字影像系统(上海山富科学仪器有限公司)，354CE型酶标仪(芬兰Themo Electron公司)。

1.2动物模型建立及分组将MCT粉剂加入乙醇和生理盐水混合液[V(乙醇)V(生理盐水)= 28]配成10 g/L溶液。78只SD大鼠采用随机数字表法分为对照组(n=20)和模型组(n=58)。模型组以30 mg/kg剂量腹腔注射MCT，对照组腹腔注射生理盐水。至4周右心衰竭模型形成，对照组又随机分为正常对照4周组(N1组，n=10)和正常对照6周组(N2组，n=10)。模型组有3只死亡，余55只随机分为心衰4周组(F1组，n=11)、心衰6周组(F2组，n=11)、卡托普利治疗组[C组，5 mg/(kg·d)，n=11]、西地那非治疗组[S组，10 mg/(kg·d)，n=11]、两药联合治疗组(C+S组，n=11)。C组、S组、C+S组从第5周开始给药，每天早晨1次灌胃至第6周。N2组、F2组同时给予等量蒸馏水灌胃。

1.3血液及组织标本的留取于4周或6周末抽取循环血液3 mL，然后将动物处死，完整切取肝脏、心脏，冰盐水冲洗。称量肝脏质量，计算肝脏与体质量的比值，即肝脏系数。修剪心脏，分别称量右室、左室加室间隔的质量，计算右室与左室加室间隔的比值×100%(即右室肥厚指数)和左室与体质量的比值。切取部分右室心肌组织用40 g/L多聚甲醛固定。

1.4血清TGF-β1的检测将抽取的血液迅速4 ℃离心5 min(4 000 r/min)，取血清，采用ELISA法检测TGF-β1水平。用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的吸光度，通过标准曲线计算待测样品的含量。

1.5心肌组织TGF-β1蛋白表达的免疫组化法检测心肌标本3 μm厚切片，常规脱蜡至水，PBS冲洗，抗原加热修复，室温冷却，PBS缓冲液漂洗，体积分数3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温20 min，操作步骤按SP试剂盒进行。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。胞质或胞膜呈棕黄色为阳性表达。采用Biosens数字图像分析系统进行定量分析，测定阳性区的吸光度和面积，以两者的乘积表示目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，定量资料均进行正态性与方差齐性检验，两组间比较应用独立样本t检验或校正的t检验；卡托普利或西地那非对模型组各指标影响应用2×2析因设计的方差分析；应用pearson积差相关系数分析F2组大鼠血清和右室心肌TGF-β1蛋白表达的相关性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠一般状态变化第1周模型组大鼠与对照组在精神状态、活动量、进食、体质量增加方面无差异。第2周后模型组大鼠精神状态较对照组差，活动量、进食较对照组少，体质量增长缓慢。4周时对照组大鼠20只全部存活，模型组大鼠有3只死于严重心衰，存活者均表现为精神萎靡，被毛蓬松无光泽，静息状态下呼吸急促，食欲低下，活动量明显较少等心力衰竭症状。6周末N2组全部存活，F2、C、S及C+S组各存活10只。

2.2模型组大鼠右室心肌细胞的变化4周时F1组大鼠右室心肌切片见心肌细胞排列紊乱，部分肌浆溶解，可见空泡变性，F2组变化更明显，见图1。

2.3 4周与6周时各观察指标的比较见表1、2和图2。

2.4药物干预对各观察指标的影响见表3。

2.5F2组大鼠血清和右室心肌TGF-β1蛋白表达的相关性相关分析结果显示，F2组大鼠血清TGF-β1水平和右室心肌TGF-β1蛋白的表达呈正相关，r=0.665，P<0.001。

图1 右室心肌细胞形态变化(HE，×400)

表1 4周时各观察指标的比较

表2 6周时各观察指标的比较

*：与表1中F1组比较，t=0.189，P<0.001；#：与表1中F1组比较，t=3.931，P=0.002。

图2 右室心肌TGF-β1蛋白的表达(SP，×400)

表3 6周末模型组大鼠各观察指标比较

3 讨论

根据作者[4]以往的实验结果，该实验采用单剂量MCT腹腔注射的方法建立右心衰竭模型。MCT在肝脏内经单氧化酶转化后，通过血液循环到达肺，引起作为靶细胞的肺动脉血管内皮细胞不可逆损伤及继发的炎症反应，导致肺血管重塑及肺动脉高压，逐渐形成右心衰竭。该实验中4周后幼鼠出现右心衰竭的表现，与对照组相比，肝脏系数、右室肥厚指数明显升高，光镜下观察右心室心肌切片示心肌细胞排列紊乱，心肌纤维分叉，核浓染，部分肌浆溶解，并可见空泡变性，说明右心衰竭模型构建成功。

TGF-β1是一组调节细胞生长和分化的细胞因子，它能使Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等mRNA及蛋白表达增加，促进心肌纤维化的发生[5]。研究[6]证实其在心肌纤维化的形成中起关键作用。

心衰时神经内分泌系统的激活是其进展的主要原因，主要表现为RASS系统的激活。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)通过刺激TGF-β1合成，促进细胞肥大和纤维化发生。给予TGF-β1基因缺陷小鼠AngⅡ后未发现明显的左室心肌肥大和纤维化[7]。ACEI通过阻断血管紧张素转化酶(ACE)减少AngⅡ的生成。该实验结果显示，右心衰竭大鼠肝脏系数、右室肥厚指数明显升高，血清TGF-β1、右室心肌TGF-β1蛋白表达较对照组显著升高；6周时心衰组大鼠TGF-β1的水平较4周时升高明显，应用卡托普利后上述指标均改善。提示TGF-β1参与右心衰竭时心肌肥厚的发生发展，其水平与右心衰竭程度相关，卡托普利可通过降低TGF-β1而改善心功能。

PDE是细胞内第二信使cAMP、cGMP降解的关键酶，PDE5是这个超家族成员之一，以往认为PDE5在心肌表达量很少，所以不可能起到重要的生理作用。新近研究[8]发现，在人和动物中，正常的右室心肌不表达PDE5，但PDE5 mRNA及其蛋白在肥大的右室心肌中高度表达，PDE5抑制剂可有效增加心肌收缩力，降低后负荷，但不影响体循环血流动力学。西地那非是特异的PDE5抑制剂，其化学结构与cGMP相似，可以与cGMP竞争PDEs的结合部位，从而抑制cGMP水解，使细胞内cGMP水平上升。cGMP可以激活cGMP依赖的蛋白激酶G(PKG)-激活K+通道，进而抑制钙离子通道，引起细胞内钙离子浓度的减低[9]。有报道[10]心衰患者口服西地那非可提高运动耐量，改善右心功能。该实验中给予西地那非后，右室肥厚指数较心衰组下降，提示右心肥厚有所减轻，可能与西地那非抑制钙离子通道，降低了细胞内钙离子浓度，引起肺血管舒张，后负荷降低有关。同时血清TGF-β1、右室心肌TGF-β1蛋白亦下降，说明西地那非可抑制TGF-β1的表达，但其抑制TGF-β1表达的机制有待进一步研究。

实验结果还显示血清TGF-β1和右室心肌TGF-β1蛋白的表达呈正相关，提示TGF-β1的血清水平能够反映出右室心肌TGF-β1表达的变化，临床可通过测定血清TGF-β1含量判断心力衰竭的严重性。然而关于其与心力衰竭严重程度的相关性国内报道不一：谢亚芹等[11]的研究表明心力衰竭大鼠TGF-β1蛋白高于假手术组，且随着心力衰竭程度的加重而表达增多，与该实验结果一致；但杨震等[12]研究显示CHF患者血清TGF-β1较正常对照组明显降低，且与心力衰竭的严重程度有显著的相关性，TGF-β1浓度越低，心力衰竭越严重；国外Glazer等[13]在对老年人的心血管疾病研究中发现血清高水平TGF-β1与心力衰竭的发生密切相关。因此，关于TGF-β1在心力衰竭患者中的变化有待临床大样本研究。

先天性心脏病合并艾森曼格综合征患者口服西地那非或波生坦均可以改善血流动力学指标，提高运动耐量，二者联合应用未优于单用[14]。该实验中卡托普利、西地那非均可以通过抑制TGF-β1的表达减轻心室肥厚，改善心功能，二者联合应用具有协同作用。目前临床上尚未见二者联合应用的疗效研究，关于联用的疗效及有何副作用有待进一步临床研究。

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