miR-124过表达对肺动脉高压大鼠右心重构的影响*

郑常龙， 符永玫， 詹浩洪， 陈天天， 邹 勇， 梁彩倩△

(中山大学附属第三医院 1急诊科, 2输血科, 广东 广州 510630)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种肺血管阻力进行性升高，持续发展可导致右心肥厚和右心衰竭甚至死亡的严重心血管疾病[1]。尽管近年来用于治疗PAH的“靶向”药物，如磷酸二酯酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂等，虽能改善部分PAH患者的症状，但其不能明显改善PAH患者预后[2]。右心重构和右心衰竭是PAH患者死亡的主要原因。因此，积极探索PAH患者并发右心重构和右心衰竭的发病机制并早期进行干预，对PAH患者的预后至关重要。

多种微小RNA(microRNA，miRNA，miR)参与了PAH的发生和发展[3-4]。有研究表明miR-124在肺动脉高压患者的肺血管平滑肌细胞和慢性缺氧诱导的PAH小鼠肺组织中均显著下调，而且miR-124对肺血管平滑肌细胞的增殖有显著的抑制作用[5]，这提示miR-124在肺动脉高压的发生和发展中可能发挥了重要作用。那么，过表达miR-124能否通过抑制肺血管平滑肌细胞的异常增殖而降低肺动脉压力，进而缓解右心重构和右心衰竭呢？国内外未见相关文献报道。因此，本研究拟采用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体介导miR-124过表达的方法，观察其对野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高压大鼠右心重构的作用，并初步探讨其可能的作用机制，为肺动脉高压右心重构患者的治疗提供参考资料和新的思路，为肺动脉高压的基因治疗提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

32只6周龄SPF级雄性SD大鼠(体质量180～200 g)采购于中山大学实验动物中心，饲养于该中心SPF级动物房中。饲养环境为温度恒定(22±2)℃，湿度恒定(55±5)%，每天人工光照明暗各12 h，24 h自由饮水进食。本实验得到中山大学实验动物伦理委员会的批准(批准编号为：IACUC-DB-16-1113)。

载体pHBAAV-U6-ZsGreen购自上海汉恒生物有限公司；大肠杆菌菌株DH5α购自Invitrogen；野百合碱购自Sigma；SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen；p-Samd2、Samd2和β-actin抗体购自Cell Signaling Technology；转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗体购自Abcam；多导生理记录仪(MP150型)购自BIOPAC；实时定量PCR仪购自ABI。

2 实验方法

2.1重组腺相关病毒的包装和滴度测定 从miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)获得miR-124-3前体序列(5′-TGAGGGCCCCTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGC-ACGCGGTGAATGCCAAGAGAGGCGCCTCC-3′)，参考Luo等[6]的方法，构建质粒，经测序正确后克隆至pHBAAV-U6-ZsGreen质粒的HpaI及XhoI位点，产生AAV-miR-124重组体。重组质粒用脂质体2000共转染至293T细胞，大量包装复制AAV-miR-124，以空白质粒AAV-GFP作对照，经纯化后检测滴度。AAV-miR-124 和 AAV-GFP的滴度分别为1.4×1015vg/L和2.0×1015vg/L (vg=viral genomes)。

2.2动物模型的建立与分组 所有大鼠经随机数字表法随机分为4组：正常对照(control，n=8)组、野百合碱(MCT+NS，n=8)组、野百合碱+AAV-GFP(MCT+GFP，n=8)组和野百合碱+AAV-miR-124(MCT+miR-124，n=8)组，其中MCT+NS组、MCT+GFP组和MCT+miR-124组大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后固定于倾斜60°的大鼠操作台，插入自制的气管导管套管，使用微量注射器经气管导管分别缓慢注入100 μL生理盐水、AAV-GFP和AAV-miR-124。3周后，MCT+NS组、MCT+GFP组和MCT+miR-124组大鼠一次性经腹腔注射野百合碱(60 mg/kg)建立PAH右心重构模型，饲养5周后达实验终点。

2.3右心室收缩压(right ventricular systolic pressure, RVSP)和平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)的测定 根据邹丽珍等[7]的方法测量大鼠RVSP和MAP。简要步骤为：用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，固定后暴露颈外静脉，结扎远端，显微剪在颈外静脉近心端剪开约1/3，插入已预充盈肝素钠盐水(1×105U/L)的PE-100聚乙烯管，聚乙烯管通过换能器连接MP150多导生理记录仪，记录RVSP。稳定10 min后保存数据，退出导管。分离出颈总动脉，插入PE-50聚乙烯管，固定待波形稳定后记录动脉波形，测定大鼠平均体循环动脉压mSAP。

2.4右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI)和右心室重量指数(right ventricular weight index, RVWI)的测定 脱臼法处死大鼠后分离出心脏，洗净血液，于4 ℃ PBS中剪除心房，沿室间沟分离出右心室(RV)和左室加室间隔(LV+S)两部分，用滤纸吸干表面的水分，分别称重后计算二者的比值即为RVHI，即RVHI=RV/(LV+S)。计算右心室(RV)重量与大鼠体重(BW)的比值即为RVWI，即RVWI=RV/BW。

2.5大鼠右心天狼星红染色 右心组织块经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后切片，行天狼星红染色。染色步骤为：石蜡切片经60℃烤箱中烤片2 h后，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水，入天青石蓝液8～10 min，蒸馏水轻轻冲洗4～6 min，再入天狼星红饱和苦味酸染液染20～30 min。直接用无水乙醇快速分化和脱水，经二甲苯透明后用中性树胶封片。使用倒置显微镜观察右心组织心肌细胞的病理学改变，高倍镜(×400)下随机拍照并分析。

2.6RT-qPCR检测肺和右心组织中miR-124的表达 取大鼠肺组织100 mg(或右心组织30 mg)，加入1 mL(或0.5 mL，右心组织) TRIzol中充分研磨裂解后加入氯仿提取总RNA，纯化后用核酸蛋白测定仪测定A260/A280比值，比值在1.8～2.0之间用于实验。使用逆转录试剂盒进行逆转录，SYBR Green 法实时定量 PCR 检测miR-124的表达水平。PCR 反应体积为25 μL： cDNA 1 μL，上、下游引物各10 pmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U。miR-124的上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGTAAGGCACGCGGTGA-AT-3′，下游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；内参照U6的上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。扩增条件为：50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40个循环。PCR扩增完成后，所得结果由操作系统自动生成，目标基因的相对定量按2-ΔΔCt计算。

2.7Western blot检测右心组织中TGF-β1和p-Smad2的表达 取约50 mg右心组织，剪碎后加入RIPA裂解液，充分研磨后经离心提取上清备用。Bradford法测定蛋白质浓度。等量蛋白质用SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜上后，用含有5%脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭4 h后，分别加入抗TGF-β1、p-Smad2、Smad2和β-actin抗体(1 ∶1 000)，于4℃孵育过夜。用TBS-T于室温下洗膜4次(每次15 min)后加入Ⅱ抗，羊抗兔或小鼠IgG(1 ∶2 000)，室温孵育1 h，用二氨基联苯胺(DAB)进行显色。应用ImageJ图像分析软件进行比较分析。

3 统计学分析

所有计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，统计处理用SPSS 19.0软件，组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-124在各组大鼠肺和右心组织中的表达

与control组相比，MCT+NS组和MCT+GFP组大鼠肺组织中miR-124的表达显著减少(P<0.05)，而MCT+miR-124组miR-124的表达显著增加(P<0.05)，见图1A。4组大鼠右心组织中miR-124的表达无显著差异(P>0.05)，见图1B。

Figure 1. The expression of miR-124 in the lung (A) and right heart (B) tissues in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

图1 miR-124在各组大鼠肺和右心组织中的表达

2 各组大鼠RVSP和MAP的比较

到达实验终点前(野百合碱注射5周内)，MCT+NS组和MCT+GFP组各有2只大鼠死亡，MCT+miR-124组死亡1只，control组无大鼠死亡，4组间死亡率无显著差异(P>0.05)。MCT+NS组和MCT+GFP组的RVSP均显著高于control组(P<0.05)，与MCT+GFP组相比，MCT+miR-124组的RVSP显著降低(P<0.05)；4组动物的MAP无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠RVSP和MAP的比较

Table 1.Comparison of RVSP and MAP in each group (mmHg. Mean±SD)

GroupnRVSPMAPControl823.2±1.0128.0±7.0MCT+NS671.9±9.9*115.0±11.6MCT+GFP675.1±17.9*111.0±8.7MCT+miR-124749.3±7.7*#120.0±18.4

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

3 各组大鼠RVHI和RVWI的比较

野百合碱注射5周后，与control组相比，MCT+NS组和MCT+GFP组的RVHI和RVWI均显著增高(P<0.05)；与MCT+GFP组相比，MCT+miR-124组的RVHI和RVWI均显著降低(P<0.05)，见图2。

4 各组大鼠右心室天狼星红染色

天狼星红染色结果显示， control组大鼠右心室心肌细胞排列整齐，大小较均一，分布较均匀，胶原沉积较少；MCT+NS组和MCT+GFP组大鼠心肌细胞肥大且排列紊乱，胶原沉积显著增多； MCT+miR-124组心肌细胞排列稍紊乱，与MCT+GFP组相比，心肌细胞肥大减轻，胶原沉积显著减少，见图3。

5 大鼠右心组织中TGF-β1和 p-Smad2蛋白表达的比较

Western blot检测结果提示，与control组相比， MCT+NS组和MCT+GFP组右心组织中TGF-β1和 p-Smad2的表达显著上调(P<0.05)，而与MCT+GFP组相比，MCT+miR-124组大鼠右心组织中TGF-β1和 p-Smad2的表达显著下调(P<0.05)，见图4。

Figure 2.Comparison of RVHI (A) and RVWI (B) in each group. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

图2 各组大鼠RVHI和RVWI的比较

讨 论

肺动脉压力进行性增高导致的右心重构和右心衰竭是影响PAH患者预后的重要因素[8]。尽管近年来，超声心动图和磁共振成像在右心室解剖和病理评估上取得了很大的进展，但目前PAH右心室重构的机制仍不明确，临床上尚没有直接或选择性治疗右心衰竭的有效方法。因此，寻找一种有效改善右心重构和右心功能的方法有重要的临床意义。

MCT诱导的大鼠PAH和右心重构模型与临床上右心重构和右心衰竭的发生和发展过程相似，具有经济、简便和可复制性等特点，是目前常用的研究PAH和右心重构的动物模型[9]。单剂腹腔或皮下注射MCT(60 mg/kg)可导致大鼠肺动脉血管平滑肌和血管外膜成纤维细胞的异常增殖和迁移，肺内小动脉中膜肥厚，肺动脉压力进行性增高，4～5周可出现右心室重构和右心衰竭，甚至死亡[10]。本研究中，MCT+NS组和MCT+GFP组大鼠从MCT注射后第3周开始出现体质量增幅减少甚至下降，第4周开始出现活动量显著减少、呼吸困难等右心衰竭症状。到达实验终点时，MCT+NS组和MCT+GFP组大鼠RVSP和RVHI均显著高于control组，右心的心肌细胞肥厚程度、胶原纤维沉积显著高于control组，表明大鼠右心重构模型建立成功。

Figure 3.Over-expression of miR-124 attenuated right ventricular myocardial remodeling induced by monocrotaline (MCT) in rats (Sirius red staining). The scale bar=50 μm.

图3 miR-124过表达减轻野百合碱诱导的大鼠右心室心肌重构

Figure 4. The expression of TGF-β1and p-Smad2 in right heart tissues in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=6～8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMCT+GFP group.

图4 各组大鼠右心组织中TGF-β1和p-Smad2蛋白的表达

近年来，越来越多的研究表明miR-124在PAH的发病和进展中起着非常重要的作用。本研究的结果提示，miR-124在野百合碱诱导的PAH大鼠肺组织中的表达显著下降，而AAV介导的miR-124过表达可显著降低野百合碱诱导的RVSP和RVWI，减少右心室胶原沉积，减轻右心重构。肺动脉血管平滑肌和血管外膜成纤维细胞的异常增殖和迁移是PAH的病理生理基础。Kang等[5]的研究表明，miR-124在肺动脉高压患者肺组织以及低氧诱导的PAH小鼠的肺血管平滑肌细胞中均显著下调；miR-124可通过作用于PTBP1基因进而抑制肺血管平滑肌细胞的增殖。Wang等[11]研究证实，miR-124在肺动脉高压患者及牛肺动脉外膜成纤维细胞中的表达显著下调；过表达miR-124能显著抑制成纤维细胞的增殖和移行。因此，我们推测过表达miR-124降低肺动脉高压、减轻右心室重构的机制可能与其抑制肺血管平滑肌细胞和成纤维细胞的异常增殖有关，但其具体机制需进一步研究。

TGF-β1是一种具有多功能生物学活性的细胞因子[12]。TGF-β1与其受体结合后，可激活其下游的信号分子Smad2/3，活化的Smad2/3和Smad4结合，入细胞核后可调控细胞的增殖和迁移、基质的形成、损伤修复和间质纤维化等活动[13]。本研究中，我们发现TGF-β1和 p-Smad2在正常大鼠的右心组织中低水平表达，在MCT+NS组和MCT+GFP组大鼠右心组织中的表达显著上调，提示TGF-β1/Smad2信号通路的激活参与了右心重构。Long等[14]的研究结果也表明，TGF-β1抑制剂可降低MCT诱导的PAH,减轻右心重构。在本研究中，miR-124过表达可导致TGF-β1和p-Smad2的表达均显著下调，这提示miR-124过表达可能通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路的激活从而改善右心重构。但是，由于AAV-miR-124是通过气管局部给药，其在肺组织中的表达显著增加，但在右心组织中的表达与其它3组相比无显著差异。因此，肺组织中过表达的miR-124并非直接下调右心组织中TGF-β1和 p-Smad2的表达，而是可能通过降低肺动脉的压力、减轻肺循环阻力，进而导致TGF-β1和p-Smad2的表达下调，从而减轻右心室心肌重构。腺相关病毒是一种无致病性的人细小病毒，具有转染效率高、免疫原性低、可感染多种细胞且能长期稳定表达等优点，是目前基因治疗研究最为常用的载体[15-16]。在本研究中，miR-124在肺和右心组织中表达结果显示，AAV-miR-124重组体通过气道给药后主要在肺组织中表达，表明AAV具有明显的嗜肺性，这与Halbert等[17]的报道相一致。4组大鼠在死亡率上无显著差异，但与MCT+NS组和MCT+GFP组相比，MCT+miR-124组大鼠有较低的死亡率，表明AAV介导的miR-124过表达有一定的安全性。

综上所述，本研究通过AAV介导的miR-124的过表达的方法，可有效降低野百合碱诱导的右心室收缩压、减轻右心重构。本研究有望为肺动脉高压和右心重构的基因治疗提供新的思路。