活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏BMP-7及TGF-β1表达的影响

杨瑞凤，王建生，张宛哲，赵瑛瑛，孟晶茜，申鹏霄，张文吉

郑州大学第二附属医院肾内科 郑州 450014

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常见的并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]，其确切的发病机制尚未完全清楚，目前治疗效果不理想。活性维生素D3的生物学作用广泛，其功能研究集中在调节钙磷代谢、细胞增生与分化、骨的再建及免疫调节[2]方面，近年来活性维生素D3的肾保护作用越来越受关注。转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)高表达是导致糖尿病肾损害的重要环节。骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)又称成骨蛋白-1，属转化生长因子超家族，能促进新骨的生成及修复，促进成骨细胞与软骨细胞的分化，是重要的肾保护因子，可通过抑制TGF-β1发挥抗肾纤维化作用[3]。作者观察了活性维生素D3对糖尿病大鼠肾脏BMP-7和TGF-β1表达的影响，探讨活性维生素D3肾脏保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；骨化三醇，上海罗氏公司；全自动生化仪(日立7600-010)；兔抗大鼠BMP-7多克隆抗体，北京博奥森公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体，Santa Cruz公司；Trizol及RT-PCR试剂盒，北京全式金生物有限公司；免疫组化试剂盒及免疫荧光试剂盒，北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.2实验分组雄性SD大鼠36只，体质量225～275 g，由郑州大学实验动物中心提供。大鼠禁食不禁饮12 h后，随机取24只一次性腹腔注射60 mg/kg STZ(STZ用0.1 mmol/L无菌枸橼酸缓冲液配制，pH4.5)[4]，72 h后尾静脉取血测血糖，血糖>16.7 mmol/L者为糖尿病大鼠，共造模成功22只。将22只大鼠随机分成糖尿病模型(DM)组，活性维生素D3(DC)组，每组各11只。余12只大鼠随机选取11只为正常对照(NC)组。DC组在模型建立后，将骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/(kg·d)的剂量灌胃[5]，NC组与DM组给予等量的花生油灌胃。实验期间大鼠均给予标准饮食，自由饮水，12 h光照周期，12周后处死，期间每组各死1只。处死前收集4～6 mL静脉血、24 h尿。切取双侧肾脏，称重，计算肾脏肥大指数，肾脏肥大指数=肾质量/体质量。取部分肾组织常规制片，其余肾组织液氮保存。

1.3肾组织形态学观察常规石蜡切片，PAS及Masson染色，观察肾小球基底膜、系膜区、肾小管及肾间质的改变。

1.4生化指标检测采用全自动生化仪检测24 h尿蛋白定量、血钙(Ca)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、血肌酐(Scr)。

1.5肾组织BMP-7、TGF-β1mRNA的检测采用RT-PCR法检测。取约100 mg肾皮质按照Trizol说明书提取总RNA，取5 μg反转录成cDNA，进行PCR扩增。引物由北京博大泰克公司合成。BMP-7引物序列：上游5’-AAACAGCAGCAGTGACCAGA-3’，下游5’-GTCGTCGAAGTAGAGGACAGATA-3’，退火温度55 ℃，扩增产物长度为274 bp；TGF-β1引物序列：上游5’-CATCCCGCCCACTTTCTAC-3’，下游5’-CAAGCAGGTCACCATTTCA-3’ ，退火温度54 ℃，扩增产物长度1 759 bp；β-actin引物序列：上游5’-CCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游5’-GGAAGGTG GACAGTGAG-3’，退火温度58 ℃，扩增产物长度568 bp。产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用紫外线投射仪观察，用凝胶成像分析系统测定条带的吸光度，以目的基因与内参条带吸光度的比值表示目的基因mRNA的表达水平。

1.6肾组织BMP-7、TGF-β1蛋白的检测石蜡切片脱蜡水化后，用体积分数3% H2O2处理内源性过氧化氢酶，抗原热修复，山羊血清封闭后，分别滴加兔抗大鼠BMP-7多克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体(均按100倍稀释)。37 ℃孵化30 min，4 ℃过夜。加入生物素二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。阳性信号为棕黄色着色。应用病理图像分析系统(上海山富科学仪器有限公司)做半定量分析，每个切片测定20个含肾小球的视野(×200)，测定阳性区积分光密度值，取均值作为最终结果。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析，3组间肾脏肥大指数、生化指标、肾组织中TGF-β1和BMP-7 mRNA及蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1肾组织形态学表现见图1。NC组大鼠肾小球、肾小管结构清楚，基底膜厚度均一，毛细血管腔开放良好,间质未见炎性细胞浸润、纤维组织增生。DM组肾小球体积明显增大，基底膜增厚,系膜基质明显增多，部分毛细血管襻融合、扩张，部分肾小管上皮细胞肿胀，肾间质可见大量的淋巴细胞浸润，纤维成分明显增多。DC组系膜细胞及基质增生减轻，病变较DM组减轻。

图1 3组大鼠肾组织病理改变(×400)

2.2 3组大鼠肾脏肥大指数及生化指标的比较见表1。

表1 3组肾脏肥大指数、24 h尿蛋白定量、血Ca、血BUN、Cys-C及Scr的比较

*：与NC组比较，P<0.05；#：与DM组比较,P<0.01。

2.3 3组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1mRNA的表达见图2、表2。

2.4 3组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1蛋白的表达见图3、表3。

图2 3组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1 mRNA的表达

表2 3组肾组织中BMP-7、TGF-β1 mRNA的表达

*：与NC组比较,P<0.05;#：与DM组比较,P<0.05。

图3 3组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1蛋白的表达(×200)

表3 3组肾组织BMP-7、TGF-β1蛋白表达

*:与NC组比较,P<0.05;#:与DM组比较,P<0.05。

3 讨论

中国糖尿病流行病学调查显示，我国已超过印度成为世界上糖尿病患者最多的国家[6]，DN患病率也逐年增加，在我国已成为导致终末期肾功能衰竭的主要原因。目前DN的防治手段有限，主要为对症治疗，探索新的治疗方法日趋迫切。

越来越多的研究[7]表明活性维生素D3不仅具有调节钙磷代谢作用，而且还具有抗增殖、抗分化、调节细胞凋亡、介导免疫反应等肾脏保护作用，但其具体作用机制尚不完全清楚。已证实TGF-β1可通过抑制细胞增殖、促进肾组织肥大、诱导细胞外基质表达等多种途径导致糖尿病肾组织病理改变。Aschenbrenner等[8]研究证实，活性维生素D3可以通过抑制TGF-β1信号途径Smads通路，有效延迟Fisher-Lewis慢性同种异体移植模型大鼠慢性移植肾病的发生。维生素D3还可以显著抑制系膜增生性肾炎模型大鼠肾组织中TGF-β1的表达以及Ⅰ型、Ⅳ型胶原和α平滑肌肌动蛋白的表达，抑制系膜细胞的增殖和肾小球的硬化[9]。Zhang等[10]发现维生素D3可抑制维生素D受体敲除糖尿病模型大鼠RAS系统及系膜细胞、近球细胞中TGF-β1的表达，进而减少尿蛋白，抑制肾小球肥大及肾小球硬化。该研究结果显示，DM组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA及蛋白的表达较NC组明显升高，DC组大鼠肾组织中TGF-β1 mRNA及蛋白的表达均较DM组明显下降，同时尿蛋白明显减少，病理改变减轻，表明活性维生素D3可通过下调TGF-β1表达在DN发生发展过程中发挥保护作用。

BMP-7与TGF-β1虽同属转化生长因子超家族的成员，但作用完全不同，BMP-7可拮抗TGF-β1引起的纤维化及上皮间质转化[11]，是肾脏保护因子，在多个器官中均发挥着重要作用，若肾脏早期发育中缺乏BMP-7会导致肾单位发育停止。Wang等[12]发现，在转BMP-7基因的糖尿病大鼠中，BMP-7不仅可通过抑制足细胞的脱落而减少尿蛋白，而且可减少胶原蛋白Ⅰ及纤连蛋白的表达,从而延缓肾小球硬化及间质纤维化。该研究结果显示：无论是在RNA水平还是蛋白水平，DM组肾组织BMP-7的表达均较NC组明显减少，提示BMP-7对糖尿病肾组织具有重要作用，其减少可能加重糖尿病肾脏损害；与DM组相比，DC组大鼠肾脏肥大指数下降，肾脏病理改变明显减轻，24 h尿蛋白明显减少，血肌酐及尿素氮下降，提示活性维生素D3亦可通过上调肾组织中BMP-7的表达而发挥肾保护作用。

维生素D缺乏在DN患者中普遍存在，1,25(OH)2D3较25(OH)D3缺乏更明显[13]。该研究结果显示，在STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织中BMP-7表达减少，TGF-β1表达增加，而活性维生素D3在糖尿病肾病中发挥肾脏保护作用，其作用机制可能与上调BMP-7、下调TGF-β1的表达密切相关，但对于活性维生素D3通过何种途径发挥上述作用，还有待进一步研究。

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