β-连环素对人羊膜间充质干细胞增殖的影响*

张一折，芦俊萍，张东丽，梁 硕，迟连凯，赵永辉，王满仓，何 涛，乔露华，田 毅，杨 波，马 轩，关方霞#

1)郑州大学生物工程系 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052

羊膜间充质干细胞(amniotic membrane derived mesenchymal stem cells，AMSC)是近年来备受关注的一种新型干细胞。它具有分离培养容易、增殖快、不受伦理学限制等优越性，同时呈现出低免疫原性与免疫抑制作用，体外诱导可以多向分化，是非常理想的干细胞来源。Wnt/β-连环素(β-catenin)信号是调控神经前体细胞谱系分化、神经发育及成体脑中再生神经元成熟的重要通路[1-2]，其中β-catenin的表达水平直接决定神经前体细胞(neural precursor cell，NPC)的增殖与分化[3]。Wnt属分泌型糖蛋白，与细胞表面受体结合后，抑制细胞内糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β) 活性，引起β-catenin在胞质内积累并进入细胞核，与淋巴样增强因子/T细胞因子(LEF/TCF)结合，激活转录因子，诱导相应的靶基因c-myc、neurogenins、Neuro D等表达，从而对细胞增殖分化进行调节。近来研究[4-5]发现：β-catenin活化的骨髓间充质干细胞能刺激造血干细胞的增殖，改善干细胞微环境，稳定的β-catenin表达是长期维持造血干细胞更新的基础。AMSC具有神经细胞生物学特性，能向神经元定向诱导。然而，β-catenin对AMSC增殖和分化的体内外调控作用尚不清楚。该实验旨在构建介导AMSC β-catenin高表达的重组腺病毒载体，研究其对AMSC增殖的影响。

1 材料与方法

1.1材料正常足月剖宫产胎儿的胎盘(郑州大学第一附属医院妇产科提供)，HEK293细胞(郑州大学基础医学院韩圣娜副教授惠赠)，pAd-β-catenin-GFP重组腺病毒(由郑州大学生物工程系细胞生物学研究室构建并保存)，DMEM/F12培养基(购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(购自Solarbio 公司)，鼠抗β-catenin 单克隆抗体、鼠抗GSK-3β单克隆抗体(均购自Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin 单克隆抗体、HRP 标记山羊抗小鼠二抗、蛋白质Marker(购自北京鼎国昌盛生物公司)。

1.2人AMSC的分离与培养无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的胎盘，钝性分离胎盘脐带面的羊膜约10 cm×10 cm，用PBS缓冲液充分冲洗，然后将羊膜尽可能剪碎，加入2.5 g/L的胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，终止消化后将液体倒掉，再以终质量浓度为1.0 g/L 胶原酶37 ℃消化90 min。过200目不锈钢网将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1 300 r/min离心8 min收集细胞，接种于75 mL培养瓶内，置37 ℃培养箱中培养48～72 h后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4 d全量换液1次。待细胞达到80%～90%融合时，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化。用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩、变圆，即终止消化，然后分为2～3份进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每2～3 d全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作，传代培养记为P2代，其余类推。取P3代以后细胞用于实验操作。

1.3重组pAd-β-catenin-GFP腺病毒的扩增、纯化

HEK293细胞于75 mL培养瓶生长至丰度为70%左右时，以构建好的腺病毒原液5 μL进行感染，以未加腺病毒的正常培养细胞为对照。培养24 h后，于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，并于荧光显微镜下观察GFP的荧光现象。

1.4重组pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后细胞生长状态的测定AMSC铺满瓶底70%左右时，向75 mL培养瓶中加入100 μL腺病毒悬液，轻轻晃动瓶子，使混匀。以未加腺病毒的正常培养细胞作对照。感染24 h后，接种于96孔培养板，设3个复孔，接种后24 h采用CKK-8法测板，连测5 d。测定前每孔加入10 μL CKK-8溶液于37 ℃细胞培养箱继续孵育2 h，使用多功能酶标仪在450 nm波长读取吸光度值(A)并计算重组腺病毒稳定表达的AMSCs的增殖率。增殖率=(腺病毒感染组A值/对照组A值-1)×100%。

2 结果

2.1重组pAd-β-catenin-GFP腺病毒的扩增重组腺病毒感染HEK293细胞24 h后，倒置相差显微镜下观察细胞出现病变现象，主要变化为细胞伪足缩短、变圆、有部分细胞脱落，与对照组细胞形态明显不同(图1A和B)。同时荧光显微镜下能看到荧光现象(图1C)。重组腺病毒在HEK293细胞中得以大量扩增。

图1 HEK293细胞形态(×100)

2.2AMSCs中β-catenin表达的荧光检测结果GFP标记的含β-catenin的重组腺病毒感染AMSC 48 h后，倒置相差显微镜下观察，发现感染组细胞与对照组细胞相比没有明显的形态变化，但数量上稍有增加(图2A和B)，在荧光显微镜下能看到大量的荧光现象(图2C)。

图2 AMSC形态(×100)

2.3重组pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后细胞生长状况的测定结果结果显示,第1～5天，β-catenin稳定高表达的AMSCs增殖率分别为50.0%、82.5%、92.6%、169.1%和128.2%，明显高于正常的AMSCs，说明高表达的β-catenin能有效地刺激AMSCs的增殖。

3 讨论

β-catenin在胞质中的含量升高积累，促使它可以进一步移位至细胞核内与T细胞因子形成复合物，从而激活Wnt靶基因的转录，调控细胞生长；另外，β-catenin在胞质内可与钙粘素和细胞骨架蛋白结合维持其稳定性，β-catenin的表达水平决定神经系统中NPC和神经干细胞(neural stem cell，NSC)的增殖与分化[6]。

脐血间充质干细胞、经血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞向神经元分化以及胚胎干细胞的早期增殖与Wnt 信号通路有关[7]，而关于AMSC增殖、分化调控的明确机制无相关文献报道。

β-catenin作为Wnt 信号途径的关键成员，通过正、负反馈调节干细胞的数量，在内外因素中都发挥着重要的作用[8-9]。细胞内游离β-catenin在没有Wnt 信号刺激的情况下很容易被胞内降解系统所降解，极不稳定，细胞中仅有少量的β-catenin以保证正常细胞的生理生化功能，不至于成瘤化[10]，所以引入外源的β-catenin或阻碍胞质内β-catenin的磷酸化与降解，都可以进一步促使β-catenin在胞质内的积累，达到一定量后进入细胞核。从某种程度上来说β-catenin的入核意味着Wnt/β-catenin信号通路的激活。β-catenin作为把核外信号传递到核内的信号蛋白，在Wnt信号通路中处于关键地位，该蛋白的表达水平直接影响Wnt信号通路的生物学效应。

GFP能够在紫外线的激发下发出明亮的绿色荧光[11]，被认为是一种理想的报道基因，是研究细胞基因表达和表达产物分布的最好工具[12]。作者将GFP基因融合在β-catenin基因的5’端，既保留了β-catenin的转录激活功能，又能通过GFP直接观察β-catenin在活细胞内的分布和表达。

腺病毒载体能够感染多种哺乳动物细胞，宿主范围广，包装容量大，对人致病性低，携带的外源基因在靶细胞内以附加体形式存在，并不整合到宿主染色体中，具有极低的插入突变危险性和较低的遗传毒性；转移效率高，容量大，无需辅助病毒，可插入外源基因的片段达7～8 kb；对于细胞是否处于分裂期无严格要求，能够在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；同时制备简单，可以通过超离心得到高滴度的病毒[13]。

该研究通过建立GFP标记、重组腺病毒载体介导β-catenin高表达的AMSC和体外调控β-catenin的表达，研究了经典Wnt信号通路中的β-catenin对AMSC增殖的影响。通过荧光显微镜检测显示pAd-β-catenin-GFP重组腺病毒感染AMSC后，外源β-catenin于AMSC中成功表达，且外源β-catenin对AMSC的增殖有促进作用，明显高于对照组。

总之，该研究为了解β-catenin在AMSC细胞增殖和分化中的调节作用提供了实验支持，并为优化AMSC在中枢神经性疾病中的临床治疗效果奠定了重要的实验基础。

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