原发性肝细胞癌组织中血管紧张素转化酶Ⅱ与血管紧张素Ⅱ1型受体的表达*

许亚坡，周 琳，王春峰，张连峰

郑州大学第一附属医院消化内科 郑州 450052

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床常见的富血管恶性肿瘤，生长快，易转移和浸润，总体预后较差，5 a生存率仅为3%～5%[1]。我国乙型肝炎病毒携带者约占全球的1/3[2],肝癌发病人数占到了全球的55%[3]，严重影响着人们的健康。血管紧张素转化酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2)是目前发现的惟一的ACE同工酶[4]，但有关ACE2与HCC可能的关系及其临床意义方面国内外均无相关报道。该研究采用免疫组化法对HCC、癌旁肝硬化及正常组织的ACE2和血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)蛋白表达进行检测，旨在探讨两者在HCC组织中的表达情况、相互关系及在HCC发病中的意义，有望为HCC的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1标本及试剂选取郑州大学第一附属医院2011年6月至2012年6月经外科手术切除的HCC组织标本82例及非同一批HCC患者远离癌灶无浸润的肝硬化组织标本40例(男24例，女16例，年龄31～69岁，中位年龄50岁)，取同期肝血管瘤旁的正常肝组织标本24例(男14例，女10例，年龄28～68岁，中位年龄48岁)作对照，以上均为存档蜡块，并经病理医师证实。HCC患者中男57例，女25例；年龄33～75岁，中位年龄54岁，其中<50岁者28例，≥50岁者54例；术前均未接受放化疗及免疫治疗；其中高分化癌24例，中分化癌32例，低分化癌26例；肿瘤直径<5 cm者36例，≥5 cm者46例；有门脉浸润者37例，无浸润者45例；TNM临床分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期49例。ACE2及AT1R兔抗人多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，SP检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2ACE2及AT1R蛋白的免疫组化检测操作步骤严格按试剂盒说明书进行，标本均经体积分数10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。脱蜡水化，柠檬酸缓冲液抗原高温、高压修复，体积分数3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，血清封闭非特异性抗原，滴加抗AT1R或ACE2一抗(均为1200稀释)，4 ℃过夜，滴加生物素标记的二抗，孵育后DAB显色，苏木素复染，经脱水、透明、封片后显微镜下观察。实验中以已知的阳性组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判断AT1R及ACE2均着色在细胞的胞质和胞膜上，AT1R阳性染色表现为浅黄色、棕黄色或棕褐色，ACE2为浅黄色、棕黄色或深棕色。所有切片均在高倍镜(×400)下观察10个视野，根据阳性细胞着色程度及阳性细胞百分比进行评分。着色程度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色或棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞百分比<25%为1分，25%～为2分，50%～为3分，75%～为4分。结果取2项评分之和，<10分为阴性，≥10分为阳性[5]。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析，对3种组织中AT1R及ACE2蛋白阳性率的比较采用χ2检验，对二者与HCC组织不同病理特征之间的关系采用χ2检验进行分析，HCC组织中二者的相关性分析采用列联系数，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1AT1R及ACE2蛋白在3种组织中的表达结果见图1和表1。

图1 AT1R(1)和ACE2(2)蛋白在HCC(A)、肝硬化(B)和正常肝(C)组织中的表达情况(SP,×400)

表1 AT1R及ACE2蛋白在HCC、肝硬化和正常肝组织中的表达情况 例(%)

*:3组间两两比较，P均<0.016；#：与正常肝组织比较，P均<0.016。

2.2AT1R及ACE2蛋白表达与HCC临床病理特征之间的关系两者在HCC组织中的表达均与肿瘤的分化程度、临床分期及门脉浸润有关，而与患者性别、年龄及肿瘤大小无关，见表2。

表2 HCC组织中AT1R及ACE2的表达与临床病理特征的关系 例(%)

*:校正χ2检验。

2.3HCC组织中AT1R及ACE2蛋白表达的相关性分析两者在HCC组织中的表达有关，见表3。

表3 HCC组织中AT1R及ACE2蛋白表达的关系 例

rP=0.543，P<0.001。

3 讨论

肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体内重要的内分泌系统，目前对其认识多集中在对心血管系统的作用上，参与高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等疾病的发生发展[6]。肝脏组织出现炎症、坏死时，RAS系统变得活跃，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及AT1R增多，通过激活肝星状细胞促进肝纤维化及肝硬化的形成。活跃的RAS系统可通过诱导血管内皮生长因子等活性成分的增加促使肿瘤血管的形成[7]，从而为肿瘤细胞提供营养，这可能是HCC组织中AT1R蛋白高表达的重要原因。有研究[8]已经证实RAS系统的拮抗剂可通过抑制AngⅡ起到抗纤维化的作用。

ACE2是目前发现的惟一的ACE同工酶。ACE2最重要的作用是使AngⅡ失活，将之水解生成活性七肽Ang-(1-7)，并作用于特异性的Mas受体，进而发挥其拮抗AngⅡ的作用，产生抗炎、抗纤维化等效应[9]。ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴被认为是ACE-AngⅡ-AT1R的反向调节轴[10]。有研究[11]表明ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴对肝脏具有保护作用。该研究结果显示HCC组织中ACE2的表达明显高于正常组织，说明在AT1R作用轴与肝脏病变相互促进的同时，ACE2作用轴也被激发，并可能发挥反向调节而遏制病变的效应。其保护肝脏的机制可能与ACE2可以消除AngⅡ的缩血管作用，增加局部供氧、抗纤维化有关[12-13]。与AT1R一样，ACE2也与肿瘤的发病密切相关。对胰腺癌的研究[14]已经发现ACE2具有抑制胰腺癌发生发展的作用。该研究发现HCC组织中ACE2蛋白的表达相比正常组织升高，说明ACE2作用轴同样也贯穿在HCC的发生发展中。

RAS系统的活性还与临床上肝病的临床特征、病理分级等密切相关。该研究发现HCC组织中ACE2与AT1R的表达有关，且均与肿瘤分化程度、临床分期及门脉浸润密切相关，而与性别、年龄、肿瘤大小无关。这也说明ACE2及AT1R两者参与HCC发生发展的全过程，能反映其严重程度，有助于早期诊断和预后判断。

综上所述，该研究发现ACE2及AT1R在HCC组织中表达均较正常组织升高，并且其表达与分化程度、临床分期等有密切关系，这预示着二者在HCC发病的过程中起着重要作用。进一步对其作用机制的研究有望为HCC的诊断与预后判断，尤其是为治疗开辟新的途径。

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