糖尿病对腰椎管狭窄症黄韧带骨化的影响

张 亮，倪东馗，李立军，冯世庆，刘凤松，庞小建

（1.天津医科大学第二医院骨科，天津 300211；2.天津医科大学总医院骨科，天津 300052）

黄韧带骨化（ossification of ligament flavum,OLF）为临床常见病，其中合并糖尿病并不少见，该类患者临床治疗效果差，并发症多[1]。目前,对黄韧带骨化的影像学研究较多,但对其相关危险因素报道较少。骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins,BMP-2）在黄韧带骨化的发病机制中起关键作用,但糖尿病本身是否促进腰椎黄韧带骨化，目前尚不清楚。本研究采用组织学及免疫病理学方法探究糖尿病患者黄韧带的骨化情况，为临床该类患者腰椎退变性疾病的早期预防提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年4月-2011年12月于天津医科大学第二医院骨科腰椎手术患者121例，其中男69例，女52例，年龄42～83 岁，平均年龄（57.2±6.31）岁。腰椎管狭窄症诊断标准：（1）有慢性腰痛史。（2）长期反复的腰腿痛和间歇性跛行。（3）下肢肌萎缩，腱反射减弱，腰背伸试验阳性。（4）CT和MRI 明确存在腰椎管狭窄。排除标准：合并腰椎滑脱症者，严重心脑血管疾病者，有感染、肿瘤者。将121例患者分为3组：A组：腰椎管狭窄合并糖尿病组31例。男18例，女13例。手术节段L4-S125例，L3-56例。术前CT 显示腰椎侧隐窝狭窄。B组：单纯腰椎管狭窄症52例。男35例，女17例。手术节段L4-S114例，L3-538例。术前CT 显示腰椎侧隐窝狭窄。C组（对照组）：腰椎爆裂性骨折38例。男20例，女18例。手术节段L118例，L212例，L46例，L52例。

1.2 主要试剂 兔抗人BMP-2 多克隆抗体、链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（StreptAvidin Biotin Complex，SABC）试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 影像学观察 术前对所有患者常规行腰椎CT 及MRI 检查，了解患者的腰椎管黄韧带退变情况。

1.3.2 组织形态学观察 腰椎后路手术暴露过程中取黄韧带，均取自中央部分（椎板间部），生理盐水清洗，标本采用甲醛溶液固定，石蜡包埋，厚度5μm 连续切片，HE 及结合Masson 三色染色观察，光学显微镜下观察细胞形态、数量级分布及细胞基质退变程度。

1.3.3 免疫组化测BMP-2 蛋白表达 采用免疫组织化学SABC 法。主要步骤：石蜡切片5μm，常规脱蜡至水，体积分数3%的H2O2溶液孵育及羊血清封闭后，加兔抗人BMP-2 一抗，浓度为1∶200，用PBS代替一抗作为阴性对照，4℃孵育过夜，加生物素标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，加抗生物素过氧化物酶复合物（三抗），DAB 染色，苏木素复染，梯度脱水，二甲苯透明，中性胶封片。已知阳性切片做阳性对照。

1.3.4 结果判断 BMP-2 均以细胞浆和（或）细胞核出现黄色或棕黄色为阳性,根据染色细胞百分率和染色程度进行评定和分析，每例均随机观察10个高倍视野（×400）。根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分计算阳性系数：基本不着色者为0 分，着色淡者为1 分，着色适中者为2 分，着色深者为3 分。着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6 %～25 %为1 分，26 %～50 %为2 分，51%～75%为3 分，≥75%为4 分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘为最后得分，0分为阴性（－），1～4 分为弱阳性（＋），5～8 分为中度阳性（＋＋），9～12 分为强阳性（＋＋＋）。在分析时将“－”和“+”定位为低表达，“＋＋”和“＋＋＋”定为高表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计学处理，计量资料以±s 表示，计数资料以例（%）形式表示。多组间比较采用χ2检验，P <0.05为差异有统计学意义。组间两两比较，调整检验水准，P <0.02为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学观察 A组：典型病例CT 可见明显的黄韧带骨化，MRI 显示黄韧带肥厚，腰椎管狭窄，见图1。B组：CT 未见黄韧带骨化。C组：CT 未见黄韧带骨化。

2.2 组织形态学观察 A组：黄韧带弹力纤维减少，直径减少、变细，排列杂乱而无规则，部分断裂变形，胶原纤维成分显著增加，将弹力纤维分隔，可见软骨钙化，软骨细胞散在分布，可有软骨细胞空泡样变性，可见较多骨细胞。B组：黄韧带弹力纤维减少，胶原成分显著增加，排列杂乱而无规则，部分断裂变形,有少量软骨细胞，纤维周围可见少量骨细胞。C组：黄韧带以弹力纤维为主，弹力纤维与黄韧带的长轴平行，直径大致相等，排列紧密而规则，表面光滑。弹力纤维间可见少量的胶原纤维和散在的成纤维细胞。成纤维细胞及胞核呈纺锤状，显示稀少的胞浆和胞浆物质，未见软骨细胞及骨细胞，见图2。

2.3 免疫组织化学结果 免疫组化检测黄韧带中BMP-2，见图3。A、B、C组BMP-2 高表达率分别为68%（21/31）、29%（15/52）和16%（6/38），3组间差异有统计学意义（χ2=21.71，P<0.01）。其中，A组高于B组（χ2=11.96）和C组（χ2=11.71，P 均<0.01）。B组与C组差别无统计学意义（χ2=2.09，P=0.12），见表1。

表1 各组BMP-2 阳性细胞表达（n）Tab 1 Positive expression of BMP-2 in each group（n）

3 讨论

糖尿病是代谢性疾病，对全身多器官均有影响，包括骨与关节[2]。临床研究表明：腰椎管狭窄症患者中糖尿病的发病率高于正常人群的发病率[3]，在腰椎疾患中糖尿病患者的比例可达到18.2%[4]，即可能糖尿病与腰椎管狭窄症有密切的关系。对于糖尿病患者，本身就容易出现末梢神经病变，而腰椎管狭窄症可以出现马尾神经及神经根受压，导致间歇性跛行及疼痛麻木症状加重，从而使病因诊断困难，因此，明确糖尿病和腰椎管狭窄症联系对于鉴别诊断和治疗具有重要作用。

正常黄韧带有助于限制和防止相邻脊椎的异常活动，维持脊柱稳定和人体直立姿势，保护脊髓和马尾神经。但黄韧带骨化又是引起椎管狭窄症状的主要病理生理机制之一，骨化的黄韧带可产生脊髓、马尾神经及神经根受压症状[5]。目前临床发现，胸椎是黄韧带骨化的高发节段[5]，但腰椎黄韧带也存在骨化倾向[6]，占黄韧带骨化患者的33%[7]，而腰椎黄韧带骨化压迫神经症状更为明显，因此研究腰椎黄韧带骨化更具有临床意义。

目前多项研究表明黄韧带骨化的主要病理改变是胞外基质胶原纤维含量明显增加、弹力纤维减少、新生血管形成等，黄韧带骨化程度与纤维化程度、弹力纤维减少程度呈线性关系[8]。力学因素对黄韧带骨化具有明显地促进作用：力学机制在细胞基因表达、蛋白合成起着重要作用，机械应力可以促进韧带的骨化[9]。本研究通过组织学观察表明：糖尿病患者黄韧带内弹性纤维减少，黄韧带变性，胶原纤维增多，部分纤维断裂，该结果表明糖尿病本身即可造成黄韧带的病变而缺乏弹性，黄韧带弹性的下降即可导致脊柱不稳定，退变改变了黄韧带的生物力学，生物力学出现下降，因此，黄韧带退变本身即可造成韧带骨化，从组织学观察也可以证明，在单纯腰椎管狭窄组，也可见到骨细胞，而在单纯骨折组，未见骨细胞，因此，糖尿病对黄韧带退变的影响导致了骨化的发生。

BMPs 是一类疏水性酸性蛋白，主要存在于骨组织中，其中BMP-2 含量最多，作用最强，其主要的生物学作用是诱导未分化的间充质细胞分化为软骨和骨组织，可在骨内部分形成新骨，也能异位形成新骨，是第一个被确认能引起异位骨化并能诱导成骨样细胞或骨前体细胞向成骨细胞分化的生长因子。BMP-2 直接或基因转染都可以诱导正常人的黄韧带细胞和成骨基因的表达和钙结节的形成[10]，所以BMP-2 可能在韧带骨化中扮演了促进因子的启动因子和促进因子的角色。本研究结果显示：与单纯腰椎管狭窄组及对照组相比，糖尿病组BMP-2 表达量增高，提示具有较高的骨化倾向。在单纯腰椎管狭窄组与对照组相比，BMP-2 表达差别并无统计学意义，表明糖尿病本身即是黄韧带骨化的危险因素，而腰椎管狭窄症的出现与BMP-2 的增高不能得出因果关系。

糖尿病导致韧带骨化的机制目前仍不清楚，研究表明目前关于BMP-2 基因多态性和韧带骨化发病率关系的研究结果并不一致[11]，说明BMP-2 并不是韧带骨化发病的唯一因素，同时机械应力可以刺激韧带细胞的BMP-2，提示可能BMP-2 是连接局部和外部因子的桥梁[12]。高血糖与糖尿病血管钙化、肾脏、皮肤成纤维细胞的过度增殖以及细胞外基质的过度沉积有关，高血糖代谢的糖基化产物在体外可以促进后纵韧带骨化症患者韧带细胞的成骨基因的表达以及诱导细胞产生BMP-2[13]。目前研究表明，胰岛素是骨发生中的合成代谢因素，体外能促进骨样细胞或骨前体细胞的骨向分化，糖尿病患者常出现高胰岛素血症，而高胰岛素血症和骨密度成正相关[14]，高胰岛素血症也常见于脊柱韧带骨化者[15]，具体机制仍需进一步研究。

综上所述，本研究通过对糖尿病合并腰椎管狭窄手术患者黄韧带的组织学及免疫组化研究表明，糖尿病患者与对照组相比，具有较高的黄韧带退变骨化病理表现，提示糖尿病是导致黄韧带退变骨化，继而成为腰椎管狭窄症的危险因素之一。但由于糖尿病涉及全身多个器官及多个代谢途径，对腰椎管狭窄症黄韧带退变骨化的发病作用可能是多方面的，这是一个十分复杂的过程，详细的机制还有待于进一步深入研究。

（本文图2、3 见封三）

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