中华苦菜中不同溶剂逐级提取物抗氧化能力研究

许宝平，牛黎莉，贾 清

（1.甘肃省产品质量监督检验东部分中心，甘肃 天水 741000；2.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）

中华苦菜(Ixeris chinensis Thumb1Nakai)为菊科(Asteraceae)苦苣属(Sonchus)1年生或2年生草本植物，又称苦苣菜、苣荬菜和甘马菜等，主要分布于我国北部、东部、南部及西南部，是一种药食同源的植物。《本草纲目》载“苦菜味苦、寒、无毒，有安心益气、治血淋痔疹、利小便，疔肿、蛇咬等功效”。现代医学研究表明：苦菜具有防止贫血、消暑保健、提高免疫力、抗肿瘤、促进男子精子活力和有助于伤口愈合等功效，[1-2]也具有抗炎保肝，抗烟碱，抗氧化，抗病毒，抗白血病等作用。[3]

苦菜含有甘露醇、生物碱、甙类、苦味素及黄酮类等多种成分，具有一定的抗氧化特性。而现在常用的抗氧化剂如2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）及没食子酸丙酯（PG）等，多为化学合成物质，其安全性已引起人们的质疑，因此，寻求高效、广谱、安全的天然抗氧化物已经成为国内外研究的热点。[4]本文以苦菜为原料，采用羟自由基·OH体系、H2O2体系以及还原能力体系，初步研究了不同溶剂提取物的抗氧化能力，旨在为苦菜的进一步开发研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为中华苦菜，5月中旬采自甘肃榆中。采回的鲜样洗净阴干，粉碎过筛后装于棕色瓶内储藏备用。

1.2 实验试剂

硫酸亚铁、乙醇、丙酮、番红、乙二胺四乙酸、过氧化氢、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α—萘胺、磷酸、碘化钾、硫代硫酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、可溶性淀粉、核黄素、甲硫氨酸等试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

双光束紫外可见光分光光度计（UV-2450型）：北京瑞利分析仪器公司；RE-5298旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HH-4恒温水浴锅：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；KUBOTA-3740离心机（久保田高速冷冻落地式离心机）；SHZ-IIIB循环水真空泵：江临海市精工真空设备厂；101-2E电热鼓风电热恒温干燥箱：上海仪器仪表(集团)有限公司；AL-104电子天平：上海台衡仪器仪表有限公司；索氏抽提器；移液枪；冰箱。

1.4 方法

1.4.1 苦菜活性成分的提取

1.4.1.1 石油醚提取

精称样品5.000g→置于洗净的圆底烧瓶中→往瓶中加入150mL石油醚→放水浴中浸提（20℃，8h）→抽滤→滤液冷冻离心（1℃，4000rpm，20min）→将上清液旋转蒸发（水浴温度：20℃）→向圆底烧瓶中加入5mL石油醚→在超声波清洗器上清洗→清洗液转移到小离心管中置冰箱中保存备用（1号样）→得残渣1.

1.4.1.2 乙酸乙酯提取

残渣1→置于洗净的圆底烧瓶中→往瓶中加入150mL乙酸乙酯→放恒温水浴中浸提（28℃，8h）→抽滤→滤液冷冻离心（1℃，4000rpm，20min）→将上清液旋转蒸发（水浴温度：30℃）→向圆底烧瓶中加入5mL乙酸乙酯→在超声波清洗器上清洗→清洗液转移到小离心管中置冰箱中保存备用（2号样）→得残渣2.

1.4.1.3 丙酮提取

残渣2→置于洗净的圆底烧瓶中→往瓶中加入150mL丙酮→放恒温水浴中浸提（30℃，8h）→抽滤→滤液冷冻离心（1℃，4000rpm，20min）→将上清液旋转蒸发（水浴温度：35℃）→向圆底烧瓶中加入5mL丙酮→在超声波清洗器上清洗→清洗液转移到小离心管中置冰箱中保存备用（3号样）。

1.4.1.4 乙醇提取

残渣2→置于洗净的圆底烧瓶中→往瓶中加入150mL乙醇→放入恒温水浴中浸提（35℃，8h）→抽滤→滤液冷冻离心（1℃，4000rpm，20min）→将上清液旋转蒸发（水浴温度：40℃）→向圆底烧瓶中加入5mL乙醇→在超声波清洗器上清洗→清洗液转移到小离心管中置冰箱中保存备用（4号样）。

1.4.1.5 水提取

残渣→置于洗净的圆底烧瓶中→往瓶中加入150mL蒸馏水，浸泡→放入恒温水浴中浸提（40℃，8h）→抽滤→滤液冷冻离心（1℃，4000rpm，20min）→将上清液旋转蒸发（水浴温度：60℃）→向圆底烧瓶中加入5mL无菌水→在超声波清洗器上清洗→清洗液转移到小离心管中置冰箱中保存备用（5号样）。

1.4.2 清除羟基自由基能力的测定

参照刘锡建方法[5]并修改。利用Fenton反应法，即Fe2+催化H202产生羟自由基：

·OH可特异地使番红褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。番红在波长520nm处有最大吸收，在体系中加入具有清除·OH作用的提取液，若能及时清除·OH，则番红的褪色程度降低，从而导致吸光度值减小的程度降低。测定含有提取物的反应液的吸光值，与空白液比较，从而得出提取物对·OH的清除率。

具体操作：分别于25mL容量瓶中加入0.2mol/L pH值为7.4的磷酸缓冲液1.0mL，520μg/mL番红溶液0.2mL，EDTANa2-Fe2+1.0mL，再加入不同体积的提取液，最后加入6%H2O21mL，加蒸馏水至刻度线启动反应；37℃恒温水浴反应1h后，在波长520nm处测吸光度A值。空白组以等体积的蒸馏水代替提取液；对照组以等体积的蒸馏水代替提取液和EDTANa2-Fe2+溶液。根据以下公式计算·OH的清除率。

1.4.3 清除过氧化氢能力的测定

参考宁正详等方法，[6]在模拟胃液条件下测定样品的过氧化氢清除率。取0.1 moL/L柠檬酸缓冲液5mL，不同体积的样品溶液，H2O定容至25mL，加入0.lmol/L过氧化氢(用时配制)1mL，置37℃恒温水浴中反应20 min，取出，加入l0%KI溶液2 mL，2mol/L H3P04溶液1 mL，暗处反应120min，用0.02 mol/L Na2S203溶液滴定。

1.4.4 还原能力测定

采用普鲁士兰法测定苦菜提取液的还原能力。[7]取不同体积提取液并稀释至1.0mL，再加入0.2mol/L，pH6.6的磷酸钠缓冲液1.0mL及1%的铁氰化钾1.0mL，于50℃水浴反应20min后急速冷却,加入10%的三氯乙酸溶液1.0mL，3000rpm离心10min，取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.0mL及0.1%三氯化铁溶液0.5mL，混合均匀，10min后于700nm测定其吸光值，吸光值越大表示还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 苦菜提取液对羟自由基的清除效果

由图1可以看出，四种溶剂的苦菜提取液对Fe2+-H2O2体系产生的羟自由基均具有一定的清除作用，并且随提取液浓度的增加其清除率呈增加趋势（p＜0.05）。其中水提取液的清除率最高，当浓度为0.025g/mL时，对羟自由基的清除率能达到96%.石油醚、丙酮和乙醇提取液的清除率在浓度小于0.015g/mL时，清除率的差异较为明显，当浓度大于0.015g/mL时，清除率差异逐渐变小。

图1 苦菜提取液清除羟自由基的能力

2.2 苦菜提取液对过氧化氢的清除效果

由图2可知，三种提取液对H2O2自由基都有一定的清除作用，且随着提取液浓度的增大，对H2O2自由基的清除率也增大。水提取液和乙醇提取液对H2O2都具有较强的清除能力。当提取液浓度小于0.04g/mL时，随着提取液浓度的增大，清除H2O2自由基的能力显著增强（p＜0.05）；而当提取液浓度大于0.04g/mL时，随着提取液浓度的增大，清除H2O2自由基的能力变化不明显（p＜0.05）；丙酮提取液对H2O2自由基清除能力随提取液浓度的增加而逐渐增强，但其清除能力明显低于与水提取液和乙醇提取液。

图2 苦菜提取液对过氧化氢清除率的影响

2.3 苦菜提取液还原能力的测定

由图3可知，石油醚、丙酮、乙醇和水的苦菜提取液均具有一定的还原能力，并且随着提取液浓度的增加，其还原能力在显著提高（p＜0.05）。四种提取物的还原能力为：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液＞石油醚。由图3还可以看出：当提取物浓度＞0.015g/mL时，乙醇的还原能力迅速提高，当浓度为0.025g/mL时，其还原能力达到最大。

3 结 论

图3 苦菜提取液还原能力

中华苦菜不同溶剂逐级提取物对·OH自由基及H2O2自由基都具有较强清除作用，并且随提取物浓度的增加而增大；苦菜水提取液对四种自由基的清除作用均强于乙醇提取液、石油醚提取液和丙酮提取液。不同溶剂逐级提取还原能力的大小顺序为：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液＞石油醚提取液。对过氧化氢的清除能力：水提取液＞乙醇提取液＞丙酮提取液；对羟自由基的清除能力：水提取液＞丙酮提取液＞乙醇提取液＞石油醚提取液。

[1]周宏雷,袁久荣.中华苦荬菜化学成分的研究[J].中草药,1996,27(5):267-268.

[2]许梅,王西奎,刘长欣,等.苦荬菜生物活性成分的提取与鉴定研究[J].山东建材学院学报,1998,12(4):304-308.

[3]李春霞,刘红兵,管华诗.苦荬菜属植物化学研究进展[J].天然产物研究与开发,1999,12(5):95-99.

[4]胡迎芬.火炬果穗提取物的抗氧化作用研究[J].食品科技,2003,(9):66-68.

[5]刘锡建.沙棘果渣黄酮的提取、精制和抗氧化性能的研究[D].北京化工大学硕士学位论文,2004.

[6]宁正详,张水华,高建华,等.一些果蔬对活性自由基和亚硝酸盐的消除作用[J].食品与发酵工业,1995,(2):31-35.

[7]焦仲高,刘杰超,王思新.黑莓红色素抗氧化活性研究[J].食品科技,2003,(8):63-65.