HPLC波长切换法同时测定白术及其不同麸制品中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

吴 慧，赵文龙，单国顺，贾天柱，2*

(1.辽宁中医药大学，辽宁大连 116600;2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连 116600)

白术为菊科Compositae植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，具有健脾益气，燥湿利水，安胎的功效，临床用于脾虚食少、腹胀泄泻、水肿、自汗、胎动不安等症［1］。白术的传统炮制方法主要为麸炒法和土炒法［2-3］，2010年版《中国药典》收载的是麸炒法［4］。白术的化学成分主要为挥发油，其中的倍半萜内酯类化合物白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有抗炎、抗癌、促进胃肠运动等作用［5-8］。目前白术的麸炒品大多以白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的量变化作为其麸炒后“增酯增效”［9］的评价标准，较少有文献报道将白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量共同作为评价指标。为了较全面的反映白术生、制品的质量，本实验利用波长切换色谱法［10］，同时测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量，进一步考察白术饮片及其炮制品的质量，以期更全面地反映白术生、制品的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津LC—10ATVP液相色谱仪(SPD—10AVP检测器，LC-10atvp泵，AT-330柱温箱);岛津 LC—Solution色谱数据工作站;FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司);METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER公司);KQ—250DB型数控超声波清洗器(超声电功率250 W，频率40 kHZ);规格筛(20、40、60目各一套);液化气灶;铁炒锅。

1.2 药材与试药 麦麸(市售品，辽宁中医药大学炮制教研室提供);白术(购自浙江金华，经鉴定为白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎);对照品白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(购自四川省维克奇生物科技有限公司，批号111127，纯度≥98%);甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 不同粒径麦麸的制备［11］取样品麦麸100 g，分别通过20、40、60目筛，即得＞20目、20～40目、40～60目、＜60目4种不同粒径的麦麸。

2.2 不同含水量麦麸的制备 取样品麦麸100 g，在105℃下烘干5 h［4］，平均分为4份，往每份麦麸中喷入定量清水，充分混匀，即得含水量为0%、10%(麦麸在正常环境下保存，含水量为10%左右)、20%、30%的麦麸。

2.3 蜜麸皮的制备［12］定量炼蜜置于预热锅内，加水(约为炼蜜量的1/4)稀释后，将样品麦麸倒入，乘热拌匀，搓散，用文火炒至不黏手。每100 kg麦麸，用炼蜜60 kg。

2.4 麸炒白术［1］先将炒制容器用中火加热至均匀撒入经上述处理的麦麸10 g，即刻烟起，随之投入净白术片100 g，不断翻炒，至白术呈焦黄色，逸出香气，取出，筛去麦麸，放凉。即得不同粒径、不同含水量麦麸及蜜麸皮制白术。

2.5 清炒白术［13］取净白术片100 g置于炒制的铁锅内，用中火加热，不断翻炒，至白术呈焦黄色，逸出香气，取出，放凉，备用。

2.6 对照品溶液的制备 精密称取白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为0.256、0.102、0.216 mg的混合对照品溶液。

2.7 供试品溶液的制备 取白术药材样品适量，粉碎，过四号筛，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清液过0.45μm滤膜，备用。

2.8 色谱条件

2.8.1 色谱条件的选择 Diamonsil C18色谱柱(5μm，150 mm×4.6 mm);流动相为甲醇-水(60∶40);检测波长，0～25 min(220 nm)，25～55 min(276 nm);柱温30℃;体积流量 1.0 mL/min;进样量20μL。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.8.2 测定波长的选择 取少量白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品溶液，稀释，置UV-3100型紫外分光光度计下扫描，结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ在220 nm处有最大吸收，白术内酯Ⅱ在276 nm处有最大吸收，故选择在各自的最大吸收波长下作为高效液相色谱法的测定波长。

2.9 线性关系 精密吸取白术内酯混合对照品1、2、5、7.5、10、15μL进样，按上述色谱条件测定，以峰面积分面积(mV)对进样量(μL)进行线性回归，得回归方程为:白术内酯ⅠY=643362X+156568，r=0.9995;白术内酯ⅡY=430391X－607435，r=0.9996;白术内酯ⅢY=451708X－206502，r=0.9999。结果表明，白术内酯Ⅰ进样量在0.256～3.840μg、白术内酯Ⅱ进样量在0.102～1.530μg、白术内酯Ⅲ进样量在0.216～3.240μg的范围内线性关系良好。

2.10 精密度试验 取同一对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，白术内酯ⅠRSD=1.85%(n=6)，白术内酯ⅡRSD=1.27%(n=6)，白术内酯ⅢRSD=0.85%(n=6)。

2.11 稳定性试验 将供试品溶液室温下放置1、2、4、6、8、12 h，测定其峰面积，结果白术内酯ⅠRSD=1.92%(n=6)，白术内酯ⅡRSD=1.08%(n=6)，白术内酯ⅢRSD=0.86%(n=6)。

2.12 回收率试验 精密称取已知白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含有量的同一批样品1 g，分别精密加入一定量的苍术酮及白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品，按供试品溶液制备项下操作，平行操作6份，按上述色谱条件测定，计算回收率，白术内酯Ⅰ平均回收率为100.5%，RSD为2.0%;白术内酯Ⅱ平均回收率为100.1%，RSD为1.5%;白术内酯Ⅲ平均回收率为99.4%，RSD为1.9%。结果见表1。

2.13 样品的测定 分别取生白术及其不同麸制品粉末，按照2.2项下方法制备供试品试液，分别精密吸取各供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪记录峰面积，分别带入标准曲线，计算样品中各组分的质量分数，结果见表2。

表1 回收率测定结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 生白术及其不同麸制品中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定结果(n=6)Tab.2 Determination results of atractylenolideⅠ、Ⅱ、Ⅲin Atractylodis macrocephalae Rhizoma and different kinds of Atractylodis macrocephalae Rhizoma fried with bran(n=6)

3 讨论

3.1 波长切换应用于白术的定量测定中，能够实现在同一色谱条件下，使其中有不同最大吸收波长的指标性成分能够在各自的最大吸收波长处进行检测，避免了干扰组分对待测物质测定的影响，变两次测定为一次测定，简化了白术测定的繁琐步骤，该法具有快速、简便的特点。

3.2 本实验曾选用乙腈-水，甲醇-水等不同溶剂系统作为流动相进行洗脱，发现甲醇-水系统可获得较好的峰形和合适的极性范围。最终将流动相确定为甲醇-水(60∶40)，该条件下，白术中的白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ能得到良好的分离。

3.3 本实验考察了不同的提取溶媒(甲醇、乙醇、丙酮等)、不同溶媒用量、不同提取方法(回流、索氏提取、超声提取)、不同提取时间对测定结果的影响，最终确定提取方法为以10倍量甲醇作为提取溶剂，超声提取30 min，该方法不需加热，操作简便，提取效果好。

3.4 实验结果表明，白术经过不同粒径、不同含水量的麦麸及蜜麸皮炒制后，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的量较生品及清炒品均有所上升，说明麸炒过程中辅料不可或缺，辅料麦麸对白术炒后“増酯增效”起着促进作用。同时发现，经不同的麦麸炮制后，白术中的内酯增量有所不同，其中＞20目麦麸、0%含水量麦麸及蜜麸皮炒制后的白术内酯量增加比较多，提示我们在麸炒时，辅料麦麸的某些性质(粒径、含水量、是否蜜制等)可能会影响到中药的内在质量。

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