野菊花总黄酮口腔生物黏附双层贴片质量标准研究

段晓颖，周艳梅，闫艳仓，郝亚洁，刘晓龙

(河南中医学院第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室，河南郑州 450000)

野菊花总黄酮口腔生物黏附片是一种具有生物黏附作用的双层贴片，用于治疗口腔溃疡，它由具生物黏附性的载药层和不具生物黏附性的背衬层复合而成，载药层的主要成分是黄酮类化合物，包括蒙花苷、木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素等，其中以蒙花苷为主要成分［1-4］。野菊花的临床应用十分广泛［5-6］，研究表明，野菊花主要成分总黄酮具有抗菌［7-8］、抗炎［9-11］、抗病毒［12-13］、镇痛及免疫调节［14-15］等生物活性。为更好控制该制剂的质量，依据《中国药典》2010年版项下有关测定方法，对野菊花中蒙花苷进行了TLC鉴别，并采用UV、HPLC法对野菊花中的总黄酮、蒙花苷进行了定量测定。

1 仪器与试药

LC—10AVP高效液相色谱仪(日本岛津);TU—1800PC紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);AEL—200电子天平(日本岛津);Sartorius CP225D电子天平(德国赛多利斯);HK250科导台式超声波清洗器(上海汉克科学仪器有限公司);DZKW—C电子恒温水浴锅(北京科伟永兴有限公司);野菊花对照药材(批号:120995-200704中国药品生物制品检定所);野菊花总黄酮生物黏附片(批号为 20100917、20101017、20101019，自 制);芦 丁 (批 号100080-200707，中国药品生物制品检定所);蒙花苷(批号111528-200605，中国药品生物制品检定所);水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 供试品溶液的制备 取本品20片，研细，取约1 g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 取蒙花苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 对照药材溶液的制备 取野菊花对照药材0.3 g，加甲醇15 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液作为对照药材溶液。

2.4 薄层色谱 吸取上述3种溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15∶15∶6∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝溶液，热风吹干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。如图1所示。

图1 野菊花的薄层色谱Fig.1 TLC chromatogram of Chrysanthemi lndici Flos

3 定量测定

3.1 总黄酮测定

3.1.1 对照品溶液的制备 称取芦丁对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇约30 mL，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含无水芦丁0.2 mg的对照品溶液，备用。

3.1.2 供试品溶液 取同一批野菊花总黄酮口腔生物黏附片20片，捣碎后研细，取约25 mg，精密称定，加水超声提取10 min，冷却，定容于25 mL量瓶中，得供试品液，备用。

3.1.3 线性关系的考察 吸取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置25 mL具塞试管中，各管加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠溶液10.0 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制浓度-吸光度标准曲线，回归方程 A=1.07×10－2+1.10×10－2C，r=0.9991，芦丁溶液在9.81～58.85μg/mL范围内呈良好的线性关系。

3.1.4 精密度考察 吸取供试品溶液6份，每份5.0 mL，置25 mL具塞试管中，依标准曲线项下方法，分别在510 nm下测定吸光度。测得6次吸光度的RSD为1.02%，表明精密度良好。

3.1.5 稳定性考察 吸取供试品供试品溶液5.0 mL，置25 mL具塞试管中，定容，依标准曲线项下方法，分别在10、20、30、40、50、60 min测定吸光度，计算RSD为1.79%，表明供试品溶液在60 min内稳定。

3.1.6 重复性试验 按3.1.1项下方法制备5份供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 mL，置25 mL具塞试管中，依标准曲线项下方法，测定，计算，RSD为2.36%，表明重复性良好。

3.1.7 回收率试验 称取芦丁对照品适量，配制成质量浓度为0.8356 mg/mL的对照品溶液，作为标准加样贮备液。称取已知含有量的样品9份，每份12.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入质量浓度为0.8356 mg/mL的芦丁对照品溶液，制成高中低3种不同质量浓度的溶液9份，各精密吸取5 mL，置25 mL具塞试管中。以标准曲线项下方法测定，计算，平均回收率为99.12%，RSD为1.95%，结果见表1。

表1 回收率试验Tab.1 Results of recorery tests

3.1.8 样品测定 分别称取3批样品各3份，每份约25 mg，加水超声提取10 min，冷却，定容于25 mL量瓶中，得供试品液。精密吸取供试品溶液5 mL，置25 mL具塞试管中，依标准曲线项下方法，计算，3批供试品平均含有量分别为9.21%、9.32%、9.41%。

3.2 蒙花苷测定

3.2.1 对照品溶液的制备 称取蒙花苷对照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL含蒙花苷0.1924 mg)。

3.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，研细后，混匀，取约50 mg，称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)15 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

3.2.3 色谱条件 Agilent XDB-C18色谱柱(5μm，4.6 mm×250 mm);流动相为甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1);检测波长334 nm;体积流量1 mL/min;柱温25℃;进样量10μL。对照品溶液和供试品溶液色谱图见图2。

图2 黏附片中蒙花苷高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of linarin(A)and sample(B)

3.2.4 线性关系的考察 吸取蒙花苷对照品溶液(0.1924mg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液。按上述色谱条件，分别吸取对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，蒙花苷进样量为横坐标，绘制标准曲线。回归得蒙花苷线性方程为:Y=22748753X+19982，r=0.9995。结果表明蒙花苷进样量在0.096～1.924μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

3.2.5 精密度实验 吸取质量浓度为0.3848 mg/mL标准对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，测得蒙花苷色谱峰峰面积RSD为0.31%，表明仪器精密度良好。

3.2.6 稳定性考察 吸取供试品溶液10μL，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进样，测定蒙花苷色谱峰峰面积，计算峰面积相对标准偏差RSD为0.67%，表明供试品在24 h内稳定。

3.2.7 重复性考察 称取同一批号供试品5份，每份各约50 mg，按3.2.2项下方法配制供试品溶液，测定峰面积，计算，蒙花苷的平均含有量为3.05%，RSD为0.7%。表明重复性良好。

3.2.8 加样回收率试验 称取蒙花苷对照品适量，配制成0.338 mg/mL的对照品溶液，作为标准加样贮备液。称取已知含有量的黏附片粉末25.0 mg，平行9份，分别加入上述标准加样贮备液，制备成高、中、低3种不同质量浓度的9份溶液，按供试品溶液制备方法制成加样回收液。分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定峰面积，计算加样回收率，结果见表2。

表2 蒙花苷加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

3.2.9 样品测定 分别称取3批供试品，按3.2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，依上法测定，计算，蒙花苷的含有量分别为3.079%、3.079%、3.077%。

4 讨论

4.1 近年来，生物黏附制剂发展较为迅速，野菊花总黄酮口腔生物黏附双层片属于该类制剂。它的特点是可持续单向释药，生物黏附层能较好地黏附于口腔溃疡患处，背衬层则起到赋形作用，大大延长载药面对溃疡面的覆盖和黏附时间，保护创面，同时还可阻断外界因素对溃疡面的刺激，减轻患者痛苦。该剂型使药物仅向内侧释放，减轻药物不适口味，增大药物浓度梯度，使药物缓慢释放和吸收，达到长效目的，发挥最佳治疗作用。

4.2 通过实验确定了本制剂中野菊花总黄酮的薄层鉴别方法，采用UV法和HPLC法分别测定总黄酮和蒙花苷的量，经方法学考察，证明方法灵敏、专属、快速，可作为该口腔生物黏附双层片的质量控制方法。

［1］Yerushalmi N，Margalit R.Bioadhensive-collagen-modified-liposomes:molecular and cellular level studies on the kinetics of drug release and on binding to cell monolayers［J］.Biochim biophys Acta，1994，1189(1):13-20.

［2］张正全，陆 彬.药用生物黏附材料进展［J］.中国药学杂志，2001，36(6):363.

［3］陆 彬.药物新剂型与新技术［M］.北京:人民卫生出版社，1998.

［4］Chary R B，Vani G，Rao Y M.In vitro and in vivo adhesion testing of mucoadhesive drug delivery systems［J］.Drug Dev Ind Pham，1999，25(5):685.

［5］石艳萍，田琳琳，袁劲松，等.野菊花的研究概况［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2005，3(5):434-436.

［6］王志东，梁容瑞，李宗芳.中药野菊花的药理作用研究进展［J］.医学综述，2009，15(6):906-909.

［7］魏 艳，万大伟，孟昭礼，等.野菊花中杀菌活性物质的分离和结构鉴定［J］.西北农业学报，2009，18(4):74-76.

［8］朱庆书，赵文英.超声提取野菊花总黄酮及其抑菌活性的研究［J］.化学与生物工程，2008，25(12):72-74.

［9］黄 勇，苏 韫，明海霞，等.野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠肺功能及自由基水平的影响［J］.中国老年学杂志，2011，31(19):3723-3725.

［10］陈晓宇，李 俊，程文明，等.野菊花总黄酮对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞超微结构及分泌功能的影响［J］.解剖学杂志，2008，31(4):504-507.

［11］王宝伟，李 俊，程文明，等.野菊花总黄酮对酒精性脂肪肝大鼠的防治作用［J］.安徽医科大学学报，2011，46(10):1022-1025.

［12］苏冀彦，谭丽容，赖 平，等.复方野菊花抗感软胶囊清热解毒作用的实验研究［J］.中药新药与临床药理，2011，22(5):479-484.

［13］王 丹.药用植物野菊花的研究现状及发展前景［J］，现代中药与实践，2007，21(4):59-62.

［14］陈传丁，沈艳平，屈跃丹，等.野菊花提取物药理作用研究进展［J］.吉林医药学院学报，2010，31(3):175-178.

［15］张金杰，陈宇峰，颜 鸣，等.野菊花中的黄酮类化学成分［J］.医药导报，2013，32(1):15-18.