不同方法提取的多伞阿魏挥发油化学成分及其体外抗胃癌活性比较

2013-11-01苗莉娟刘丽萍

中成药 2013年11期

盛萍，王飒，苗莉娟，姚蓝，2，刘丽萍

(1.新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，新疆乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学中医学院，新疆乌鲁木齐 830011)

多伞阿魏 Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.是新疆维吾尔族人民常用的重要药材，为伞形科阿魏属植物，仅分布于新疆古尔班通古特沙漠南缘地区的沙丘、沙地和砾石质的蒿属荒漠中，药用部位为根和油胶树脂［1］。其挥发性成分在临床上用于治疗心腹冷痛、慢性肠胃炎、胃溃疡、风湿性关节炎等疾病［2］。目前对多伞阿魏挥发油化学成分的研究虽有报道［3-5］，但这些报道的挥发油提取方法多见水蒸气蒸馏法。目前关于多伞阿魏挥发油对肿瘤细胞的作用研究鲜有报道，为了探究不同提取方法制备的挥发油在化学成分和抑制胃癌细胞SGC-7901生长方面的差异，本实验分别采用水蒸气蒸馏法、溶剂回流提取法、超声提取法、微波萃取法、微波-超声协助萃取法、渗漉提取法和超临界CO2萃取法7种方法对多伞阿魏根挥发性成分进行提取，并对其化学成分及抑制胃癌细胞SGC-7901活性进行了比较，分析其具有抑制胃癌细胞活性的主要化学成分，旨在为今后继续深入开展这一传统维吾尔药材多伞阿魏的研究和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料气相-质谱联用仪Perkin—Elemer Autosystem XL—Turbemass(PE-5MS毛细管柱:60 m×0.25 mm×0.25μm);AL204型称量天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);DRT-SX智能恒温电热套;SFE121—50—01型超临界CO2萃取装置(南通华兴石油仪器有限公司);KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);WBFY—205型微波仪(巩义市予华仪器有限公司);CW—200型超声微波协同萃取仪(上海新拓微波溶样测试技术有限公司);酶联免疫检测仪Model 680，B io—RAD。

多伞阿魏根样品于2011年5月采自新疆沙湾县，经鉴定为伞形科植物多伞阿魏Ferula ferulaeoides(Steud.)Korov.的干燥根。所有试验样品阴干，粉碎过10目筛，密封备用。人胃癌细胞株SGC-7901(武汉博士德生物技术有限公司);胰蛋白酶(Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);氟尿嘧啶5-FU(上海浩然生物技术有限公司);乙醚、无水硫酸钠、二甲基亚砜(DMSO)等试剂均为分析纯。

1.2 多伞阿魏挥发油的制备

1.2.1 水蒸气蒸馏提取法［6］取多伞阿魏根样品50 g，按《中国药典》2010年版一部附录XD挥发油测定法项下甲法进行，读取刻度，收集多伞阿魏挥发油，加无水硫酸钠适量脱水，储存于冰箱备用。

1.2.2 溶剂回流提取法取多伞阿魏根样品50 g于圆底烧瓶中，加入150 mL乙醚，40℃水浴回流1 h，用40 mL乙醚洗涤残渣，收集滤液，减压回收溶剂，无水硫酸钠干燥，得黄褐色半固体物质，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.2.3 超声提取法取多伞阿魏根样品50 g于锥形瓶中，加入150 mL乙醚超声(超声频率为400 kHz，功率为180 W)30 min，用40 mL乙醚洗涤残渣，收集滤液，减压回收溶剂，无水硫酸钠干燥，得黄褐色半固体物质，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.2.4 微波萃取法取多伞阿魏根样品50 g于特制微波器皿中，加入150 mL乙醚，微波萃取200 s，用40 mL乙醚洗涤残渣，收集滤液，减压回收溶剂，无水硫酸钠干燥，得黄褐色半固体物质，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.2.5 超声协助萃取法取多伞阿魏根样品50 g于特制器皿中，加入150 mL乙醚，微波萃取200 s，用40 mL乙醚洗涤残渣，收集滤液，减压回收溶剂，无水硫酸钠干燥，得黄褐色半固体物质，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.2.6 渗漉提取法取多伞阿魏根样品50 g于渗漉器中，加适量的50%乙醇浸泡48 h后，再加乙醇至渗漉液无色。将渗漉液分别用20 mL乙醚萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，得黄褐色半固体物质，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.2.7 超临界CO2流体萃取(SFE-CO2) 取多伞阿魏根样品50 g用超临界流体CO2动态萃取2 h。设定萃取釜的温度为40℃、萃取压力16 MPa，分离釜Ⅰ的温度40℃、压力10 MPa，分离釜Ⅱ的温度45℃、压力5.4 MPa，CO2流量65 L/h，连续萃取2 h，得黄褐色浓稠物，24 h称定质量后，储存于冰箱中备用。

1.3 挥发油成分分析条件将7种方法提取的挥发油均用以下条件进行GC-MS-计算机联用分析。

1.3.1 GC条件毛细管PE-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25μm)，载气为高纯度氦气(体积分数为99.999%)。色谱柱初始温度60℃，保持5 min，然后以2℃/min程序升温至180℃，再以4℃/min程序升温至260℃，保持20 min。进样口温度为280℃，分流比为50∶1，氦气流量为15 psi(1 psi=6.895 kPa);载气为高纯度氦气(体积分数为99.999%)。

1.3.2 MS条件离子源200℃;传输线200℃;扫描范围35～550 amμ;功率70 ev;EI电离方式;270 V光电倍增;进样量0.8μL。

1.4 细胞培养胃癌SGC-7901细胞常规培养于含1‰青霉素、20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃、5%CO2孵箱内贴壁生长，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.5 MTT法检测多伞阿魏挥发油对SGC-7901细胞增殖的抑制作用［7-10］用0.25%胰蛋白酶消化SGC-7901细胞，用完全培养基配单细胞悬液，以每孔0.4×104个接种于96孔板中，每孔100μL。培养24 h，待细胞贴壁并进入对数生长期后饥饿细胞4 h，进行干预。分3组:阴性对照组(100μL RPMI 1640+0.1%DMSO);阳性对照组(5-FU终质量浓度分别为1、10、100、1000μg/mL);供试样品处理组(供试样品终质量浓度分别为1、10、100、1000μg/mL)。其中，每组设5个复孔，于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中继续培养12 h后中止实验，取出96孔板，每孔加入10μL MTT染色液，继续培养4 h。吸弃上清，每孔加入100μL Formanzan，置摇床上低速振荡10～30 min，使结晶充分溶解。以上试验重复3次。在酶联免疫检测仪570 nm处测定吸光度(A)值，按下式求出生长抑制率(IR)，并求出半数抑制浓度(IC50)。

细胞生长抑制率%(IR)=(1-用药组平均A值/阴性对照组平均A值)×l00%。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取挥发油外观性质比较由表1可知，水蒸气蒸馏提取的挥发油为无色或淡黄色清亮透明液体，香味浓郁，其他6种方法提取的挥发油多为黄褐色稠膏状物，香味不是很明显，故在外观性状上水蒸气蒸馏提取法优于其他6种提取方法。但水蒸气蒸馏法提取的挥发油的收率为1.60%。远低于其他6种方法提取的挥发油的收率。

表1 不同提取方法多伞阿魏萃取物的性质Tab.1 Characters of volatile oils extracted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

2.2 不同方法提取挥发油化学成分分析将7种方法制备的挥发油进行GC-MS分析，通过检索N IST98质谱图库并结合质谱裂解规律进行解析。将总离子流色谱图中的峰面积进行归一化处理，求得各化学成分的相对质量分数。挥发油的化学成分及其相对质量分数见表2，总离子流图见图1。

从表2可知，从7种不同方法制备的多伞阿魏挥发油中分别鉴定出 41、30、28、30、36、31、31个化合物，共鉴定了74个化合物，占挥发油总量的 100%、98.48%、98.24%、100%、100%、98.35%、98.77%;其中均以小分子单萜烯类化合物、倍半萜烯类化合物及其含氧衍生物及脂肪族、芳香族、酯、醇类化合物组成。另外水蒸气蒸馏法和微波萃取提取的多伞阿魏挥发油样品还含有少量苯类化合物。7种提取方法均检出含有量较高的愈创木醇成分。水蒸气蒸馏法提取的成分不同于其他6种方法的化合物有30个，但含有量较大的主要有:δ-3-蒈烯、α-异松油烯、3，3-三甲基-双环［2.2.1］庚-2醇乙酸酯等成分。微波萃取的成分不同于其他6种方法的化合物有4个。除水蒸气蒸馏法外，其他6种方法提取的共有成分有11个，含有量较大的主要有:1，1-二甲基-2，4-二(1-丙烯基)环己烷、乙酸小茴香酯等化合物。

2.3 不同方法提取挥发油抑制胃癌细胞SGC-7901活性比较不同方法提取的挥发油在不同质量浓度下对胃癌细胞SGC-7901的抑制率见表3。

从表3可知，7种提取方法中，只有水蒸气蒸馏法和微波萃取法制备的多伞阿魏挥发油在1～1000μg/mL的质量浓度范围内，对胃癌细胞SGC-7901细胞的生长具有明显的抑制作用，与对照组比较差异显著，且随着药物质量浓度增加，细胞抑制率越高，呈现显著的浓度依赖性。水蒸气蒸馏法和微波萃取法制备的多伞阿魏挥发油作用24 h的IC50分别是 23.18、16.48μg/mL。其余溶剂提取法、超声波提取法、微波－超声协同萃取法和渗漉提取法制备的多伞阿魏提取物在100～1000μg/mL的质量浓度范围内，对胃癌细胞SGC-7901细胞的生长也具有明显的抑制作用，但随着药物质量浓度增加，并不呈现显著的浓度依赖性。超临界二氧化碳萃取物对胃癌细胞SGC-7901细胞的生长没有抑制效果。

表2 不同方法提取多伞阿魏挥发油化学成分及其相对质量分数Tab.2 Chemical components and its relative mass fraction of volatile oils exacted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

续表2

3 讨论

3.1 中药挥发油的化学成分一般随产地、采收季节、品种、加工方法的不同相差较大［11-15］，即使在相同实验条件下提取不同的多伞阿魏样品，所得挥发油样品的量和理化性质也相差较大。故本实验曾对升温程序进行了筛选，对GC-MS分析色谱条件的精密度、稳定性、重复性进行了方法学考察，同时选样时严格固定样品的产地、采收季节和加工方法，最终确定目前建立的方法是稳定、良好的。

图1 不同方法提取多伞阿魏挥发油的总离子流图Fig.1 TIC of the volatile oil extracted from root of Ferula ferulaeoides by different methods

表3 7种方法提取的挥发油不同质量浓度时对胃癌细胞SGC-7901的抑制率(100%)(n=5)Tab.3 Inhibition rates of volatile oils at different mass concentrations to the SGC-7901 stomach cancer cells(n=5)

3.2 目前国内有关多伞阿魏挥发油成分的报道有文献［3-5］，在文献［3］中分离了40个化合物，鉴定了17个化合物，主要由单萜、倍半萜组成。与本实验相似的是愈创木醇成分含有量最高，但化合物α-麝子油烯、β-麝子油烯及α-麝子油烯乙酸酯在本实验中未检测到;在文献［4］中作者分别从超临界二氧化碳萃取法、二氯甲烷溶剂提取法、水蒸气蒸馏提取法分离了29、10、21个化合物，鉴定了18、8、17个化合物，3种方法均检测到愈创木醇和橙花叔醇成分;在文献［5］中共分出了62个峰，鉴定了34个化合物，其中，愈创木醇量依然很高。挥发油成分主要由单萜、倍半萜、聚硫烷类、其他类组成。比较上述3篇文献，本次实验从7种不同方法制备的多伞阿魏挥发油中共鉴定了74个化合物，7种提取方法均检出含有量较高的愈创木醇成分。本次实验中许多单萜类化合物，如月桂烯、香桧烯、水芹烯、异松油烯等均为首次分离鉴定，金合欢醇、姜黄烯、石竹烯、蛇床戏、香柠檬烯、喇叭烯、古芸烯等许多倍半萜烯类化合物也是首次分离鉴定。

3.3 比较7种不同制备方法所得挥发油的化学成分，水蒸气蒸馏法提取的多伞阿魏挥发油中化学成分的结构类型最为丰富，不同于其他6种方法检测到的化合物有30个，并且以小分子单萜类化合物为主，同时含有少量苯类化合物。虽然得率较低，但是所得挥发油多为无色或淡黄色透明状液体，比较纯净，香气浓郁，分离提取也比较方便。其他6种方法中提取的多伞阿魏挥发油组分，以长链脂肪族类化合物为主，均包括单萜烯类化合物、倍半萜烯类化合物及其含氧衍生物和其他类化合物(包括脂肪族、醇、酯类化合物)，微波提取法中尚含有少量苯类化合物。同时回收率均较高，为黄褐色稠膏状物，香味不是很明显，故在外观性状上水蒸气蒸馏提取法优于其他6种提取方法。因此，如果想尽可能多的得到某个药材成分的信息量，应该尽可能多的采取较多不同的提取方法。

3.4 本实验结果表明，水蒸气蒸馏法和微波萃取法制备的多伞阿魏挥发油对胃癌细胞SGC-7901的生长有很强的抑制作用，且随着药物质量浓度上升，细胞抑制率越高，呈现显著的浓度依赖性，两种制备方法均具有小分子单萜类化合物和部分苯类化合物可能是多伞阿魏挥发油抑制胃癌细胞SGC-7901的主要原因。多伞阿魏在新疆地区的资源丰富、民间应用广泛。本研究的结果为进一步开拓多伞阿魏临床应用范围，开发这一传统维吾尔药材提供了重要理论基础和实验依据，增强了我们进一步研究其抗胃癌细胞活性的信心。目前，对多伞阿魏提取物抗胃癌细胞有效成分和作用机制的研究工作正在进行中。

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