GC-MS法测定12种含中药成分滴眼液中抑菌剂

伍海涛，廖南英，黄天来，王宁生，宓穗卿

(广州中医药大学临床药理研究所，广东广州 510405)

近年来含中药眼用制剂的临床应用有增多趋势，2005年版《中国药典》仅收录四味珍层冰硼滴眼液(珍视明)，2010年版《中国药典》新增马应龙八宝眼膏、复方熊胆滴眼液、夏天无滴眼液，另有更多已上市但尚未收录的品种及健字号中药产品。2010年版《中国药典》定义眼用制剂为“直接用于眼部发挥治疗作用的无菌制剂”［1］。除了少数自身有抗菌作用的制剂，这些眼用制剂开启后的无菌状态仍需靠添加抑菌剂维持［2］，我国现行药典对抑菌剂的添加量是一个范围，没有硬性规定［3］，而抑菌剂含有量过高对角膜细胞有损害，在一定情况下正常浓度时对角膜细胞也有损伤［4］。

本实验参考文献［5-7］对一些含中药滴眼液中常用的抑菌剂苯扎氯胺进行检测，发现其浓度较国外制剂高一倍。其他种类抑菌剂是否也存在类似问题?是否会有非法添加的物质?参考文献［8-16］采用气相-质谱法(GC-MS)对未知物质进行谱库匹配，结合对照品初步定性;用选择性离子方法(SIM)提高低响应物质的信噪比，实现定量检测。在此基础上建立了眼科制剂常用抑菌剂三氯叔丁醇、苯氧乙醇、羟苯乙酯的检测方法，对12个含中药滴眼液品种进行了检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器 GCMS—QP2010气相质谱仪(日本岛津公司)，AOC 20i自动进样器，GC-MS solution工作站，AUW220D岛津分析天平(日本Shmadzu公司)，XW-80旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)。

1.2 药品与试剂 三氯叔丁醇(Chlorobutanol，98%，购于阿拉丁试剂公司，批号31071)，苯氧乙醇(Phenylglycol，99%，购于Acros公司，批号130242500)，正十三烷(Tridecane，GC级，购于阿拉丁试剂公司，批号33701)，羟苯乙酯(ethyl hydroxybenzoate，99.0%，购于天津科密欧公司，批号2010.7.10)，正己烷(hexane，GC级，购于Sigma公司，批号305113)。

样品为市售滴眼液。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密吸取适量苯氧乙醇、正十三烷，精密称取适量三氯叔丁醇、羟苯乙酯分别置于10 mL量瓶中，正己烷溶解配成22.0、7.58、2.0、2.0 mg/mL贮备液4℃贮存。分别移取适量苯氧乙醇，三氯叔丁醇，羟苯乙酯溶液用正己烷配制成200.0μg/mL标准混合液。

2.2 样本处理方法 原装受试滴眼液摇匀，舍弃第1滴，挤出后精密吸取20μL，与正己烷溶液1 mL(含内标1.0μg/mL正十三烷)涡旋2 min，5000 r/min 离心5 min，取上清200μL，以400μL正己烷稀释混匀(含内标1.0μg/mL正十三烷)装瓶，1.0μL进样。正己烷溶液作为溶剂对照。

2.3 气相-质谱法条件

2.3.1 气相条件 DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，Agilent公司);进样口温度200℃;炉温，80℃保持5 min，10℃/min升温至200℃，保持2 min，40℃/min降温至80℃;载气为氦气，65.2 kpa，压力控制流速，柱体积流量1 mL/min;分流比为50∶1。

2.3.2 质谱条件 离子源温度250℃;界面温度200℃;溶剂截止时间3 min;阈值1000;检测器电压Relative to the tuning Result;扫描范围50～500 m/z。选择离子监测:三氯叔丁醇59.0 m/z，3.1～7.5 min;苯氧乙醇 94.0 m/z，7.5～11.5 min;正十三烷57.1 m/z，11.5～13.0 min;羟苯乙酯 121.0 m/z，13.0 ～17.5 min。

2.4 专属性试验 各对照品和受试样在全扫描模式下的总离子流图见图1，质谱图见图2，实测滴眼液中相关物质均能良好分离(见图3)，滴眼液中内含物无明显干扰。按其碎片的相对丰度和专属性选择59.0 m/z(三氯叔丁醇)，94.0 m/z(苯氧乙醇)，121.0 m/z(羟苯乙酯)，57.1 m/z(正十三烷)为监测离子，在各自对应的出峰时间段监测。

图1 混合对照品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standard sample

图2 三种抑菌剂的离子碎片图Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of three kinds of bacteriostatic

图3 实测滴眼液样本(新乐敦)气相-质谱总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of an actual sample(New Rohto)

2.5 标准曲线的制备 混合标准溶液以正己烷稀释 成 20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02μg/mL梯度标准溶液，各加入等量适宜浓度的正十三烷作为内标(终质量浓度为1.0μg/mL)。

自动进样器吸取上述溶液各1.0μL，按上述条件进样测定，以选择离子峰的面积比(A样本/A内标)为纵坐标，对照品的进样质量浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为 C1=0.9899(A样本/A内标) －0.4962，r2=0.9949，C2=6.331(A样本/A内标) －0.4861，r2=0.9946，C3=15.193(A样本/A内标) － 0.1231，r2=0.9991。

2.6 检测限和最低定量下限 按上述测定法，精密吸取线性项下对照品溶液定量稀释，以信噪比(S/N)为3∶1的质量浓度为检测限，以信噪比(S/N)为10∶1的质量浓度为最低定量限(LOQ)，重复进样6次。三氯叔丁醇、苯氧乙醇、羟苯乙酯的定量限分别为 20.0 ng/mL，50.0 ng/mL，100.0 ng/mL。

2.7 基质效应 由于检测的滴眼液种类较多，组方复杂，不易找到同时适合多个物质的有较强选择性的净化方法，因本方法样品稀释倍数较大，正己烷萃取可排除绝大部分盐类和水溶性物质，对离子化的干扰较小，选择样品直接稀释进样。

2.8 精密度试验 按标准曲线项下配制0.1、1.0、10.0μg/mL的低、中、高3个混合对照品溶液，每个浓度测定5次，计算日内精密度。三氯叔丁醇的日内RSD在2.67%和7.21%间，苯氧乙醇的日内RSD在1.36%和5.62%间，羟苯乙酯的日内RSD在2.43%和7.10%间，基本符合检测要求。

2.9 加样回收率试验 精密吸取3种标注不同抑菌剂的滴眼液各3份，分别加入等体积(0.75 mg/mL，1.5 mg/mL，3.0 mg/mL)低、中、高3种混合对照品溶液，每种质量浓度重复配制3份。按2.3项下操作，以标准曲线法计算回收率和RSD，加样回收率位于91.9% ～104.1%，均符合要求。

2.10 样品测定 精密吸取各供试品20μL，按2.2项下处理进样，每个样本平行操作一次。结果见表1。测得的抑菌剂均在规定范围类，以四个未标注待检抑菌剂的滴眼液品种作为阴性对照，三个未检出抑菌剂，一个制剂含有说明书中未标明的抑菌剂三氯叔丁醇。

表1 滴眼液中脂溶性抑菌剂含有量Tab.1 Results of bacteriostatics concentration in eye drops

3 讨论

3.1 研究对比了不同溶剂萃取的效果，采用乙酸乙酯萃取会带入较多的杂质干扰质谱检测;同时考察了OV-1701柱的分离效果，同样条件下样本峰形展开较DB-5MS差，但羟苯乙酯的峰形较好，与毛细管柱的极性选择有关。较高的炉温会导致低沸点物质(三氯叔丁醇等)过早出峰，隐没在溶剂峰中，采用80℃的起始温度并停留5min，再缓慢升高炉温至200℃，使制剂中含有的大部分挥发性成分得到展开。

3.2 利用正己烷萃取滴眼液中的脂溶性成分，采用程序升温、全扫描模式(SCAN)得到大部分挥发性成分的总离子流图，对照品结合GC-MS谱库可对大部分物质进行准确定性，有效地监测眼用制剂中的未知成分，防止未注明物质被当做干扰峰或溶剂峰忽略。确认待测物质(抑菌剂)后，针对特征离子碎片，进行选择性离子扫描(SIM)，能很好地抑制中药成分造成的背景噪声，对低浓度的受试物也可进行定量。用本法测得各滴眼液含有的抑菌剂均在规定范围类，发现其中一个制剂使用了说明书中未标明的抑菌剂。

3.3 常用眼用抑菌剂除苯扎氯胺、硫柳汞外，大部分脂溶性较好，有一定的挥发性，可以利用气相或气质联用进行检测。2010年版《中国药典》对三氯叔丁醇、羟苯乙酯的定量检测方法灵敏度较低［13］，更适合原料药的检测。本研究的三氯叔丁醇、苯氧乙醇的检测限较其他气相-质谱检测的文献报道高1～2个数量级［14-15］，与萃取方式、受试剂型有关;羟苯乙酯的灵敏度较液相-紫外检测略高［8-10，16］，与其在毛细管柱中的保留强，峰形矮胖而液相的紫外响应好有关。

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