RP-HPLC法同时测定夏桑菊颗粒中绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷

林丽美，夏伯候，刘菊妍，李 春，何迎春，姚江雄，许招懂，梁 航，廖端芳*

(1.湖南中医药大学，湖南长沙 410208;2.湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心，湖南长沙 410208;3.广州医药集团有限公司，广东广州 510130;4.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;5.广州白云山星群(药业)股份有限公司，广东广州 510288)

夏桑菊颗粒为夏枯草、桑叶、野菊花三味药材经加工制成，商品规格20袋/包，10 g/袋，具有清热解毒，清肝明目之功效。常用于风热感冒，目赤头痛，高血压等症。夏桑菊颗粒质量标准停留在部颁标准层次，该标准仅收录了该药品的处方、制法、性状、鉴别、检查、主治与功能、用量与用法、规格和贮藏九个项目，缺乏含量测定项［1］，导致市场上夏桑菊颗粒质量参差不齐，人民健康受到威胁。对于夏桑菊颗粒的君药夏枯草，研究相对较多。目前已有采用紫外-可见分光光度法和HPLC对夏枯草中迷迭香酸量进行了测定［2-4］，且对其降血压、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒等药理作用进行了较多研究［5-7］。本课题组前期对夏桑菊颗粒开展了指纹图谱研究［8-9］，同时参考2010年版《中国药典》选择夏枯草测定指标迷迭香酸和野菊花测定指标蒙花苷作为夏桑菊颗粒成分定量测定的两个质量控制成分［10-11］，但是非同步测定。基于此，本课题组在前期工作基础之上，同步测定迷迭香酸和蒙花苷的同时，增加了夏枯草果穗的特征成分异迷迭香酸苷［12］和三味药材共有成分绿原酸的定量测定。通过开展该研究，为夏桑菊颗粒的质量标准提高提供参考和借鉴，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);BPZ11D型电子分析天平(Sartorius公司);Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器(Waters公司)。

1.2 试剂 甲醇(色谱纯，TEDIA公司)，乙腈(色谱纯，TEDIA公司)，水为哇哈哈纯净水，冰乙酸(色谱纯，北京化工厂)。

1.3 对照品及样品 对照品绿原酸［13］、异迷迭香酸苷［12］和迷迭香酸［12，14］(本课题组自制，纯度大于98%)，蒙花苷(批号:111528-200202，中国药品生物制品检定所)，4种对照品的具体结构式见图1～4);夏桑菊颗粒由广州白云山星群(药业)股份有限公司提供。

图1 绿原酸Fig.1 Chlorogenic acid

图2 异迷迭香酸苷Fig.2 Salviaflaside

图3 迷迭香酸Fig.3 Rosmarinic acid

图4 蒙花苷Fig.4 Linarin

2 HPLC测定

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);体积流量 1.0 mL/min;检测波长320 nm;柱温30℃;样品温度20℃;进样体积10μL;流动相为乙腈(A)-1.0%醋酸水(B)梯度洗脱，洗脱程序为0→40 min，10%A→30%A。按照上述色谱条件，待测成分绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷分离很好，无干扰，见图5。

图5 对照品(A)和夏桑菊颗粒(B)高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Xiasangju Granules(B)

2.2 供试品溶液制备 称取夏桑菊颗粒及相应的阴性样品约2.5 g，精密称定，加甲醇50 mL，称定质量，超声 30 min(功率 250 W，频率 40 kHz)，取出，静置，放凉，补足失质量，0.22μm微孔滤膜滤过，HPLC分析。

2.3 标准曲线的绘制 分别精密称取绿原酸、迷迭香酸和蒙花苷对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到质量浓度分别为0.0389μg/μL、0.0480μg/μL和0.0386μg/μL 的对照品溶液。精密称取异迷迭香酸苷适量，配置成质量浓度为0.2104μg/μL，再稀释为 0.033664μg/μL 和0.006733μg/μL的对照品溶液。

分别精密吸取绿原酸、迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液 1、3、5、8、10、15和 20μL进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。分别精密吸取质量浓度为0.2104μg/μL的异迷迭香酸苷对照品溶液2、5、10、15、20μL;质量浓度为0.033664μg/μL的异迷迭香酸苷对照品溶液1、2、5、10、15、20μL;质量浓度为0.006733μg/μL 的异迷迭香酸苷对照品溶液 1、2、3、5、10、15、20μL，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标，进样体积为横坐标，得绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的线性回归方程分别为:Y=182283X－131274(r=0.9994，0.0389～ 0.7771μg)、Y=9109021 X － 32842(r=0.9999，0.0067 ～ 4.200μg)、Y=178507 X －142821(r=0.9992，0.0480 ～0.9600μg)和 Y=99764 X－73510(r=0.9992，0.0386～0.7714μg)。

2.4 精密度试验 分别精密吸取上述配制好的同一对照品溶液10μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其 RSD分别为0.18%、0.53%、0.44%和0.49%。

2.5 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液(批号 JA10123)10μL，分别在 2、4、6、8、10、12、24 h进样，按上述色谱条件测定绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其RSD分别为1.21%、1.52%、0.88%和0.91%。

2.6 重复性试验 取同一份样品(批号JA10123)6份，精密称定，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其 RSD分别为 1.43%、0.99%、1.18%和1.11%。

2.7 回收率试验 取同一批已知含有量的夏桑菊颗粒样品(批号JA10123)约1.25 g，精密称定，分别精密加入一定量绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液，按2.2项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.8 样品测定 按照上述色谱条件，将不同厂家的样品进行处理和进样，每一个相同厂家及批号的样品测3份，采用外标两点法计算夏桑菊颗粒中绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的平均含有量，结果见表2。

3 讨论

3.1 4个指标成分均为酚酸或黄酮，在甲醇中有较好的溶解度，选择甲醇超声，处理容易、可控;且样品呈酸性，选择醋酸水溶液作为水相，水相中醋酸比例是通过单因素多水平试验确定最佳比例为1.0%。选择乙腈作为有机相来分析中药复方，柱压稳定且较低，有利于保护仪器和色谱柱。波长选择320 nm也是基于所测化合物在该波长处均有明显吸收，且杂质干扰较少。梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

表2 样品测定结果(n=3)Tab.2 Results of sample assay(n=3)

3.2 测定结果表明，相同厂家夏桑菊颗粒4种活性成分绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的含有量相对稳定，不同厂家之间4种成分含有量差别极大，甚至有大部分厂家的样品中不能够同时测出4种活性成分，说明含某(几)种活性成分的量极低甚至没有。可见，市面上流通的不同厂家夏桑菊颗粒质量极不一致。为了促进名优大品种的发展、维护优势合法企业和保障人民健康用药，提高夏桑菊颗粒质量标准迫在眉睫。同时建议质量标准中绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷4种活性成分的含有量下限分别为 1.50、0.20、2.00和1.00 mg/袋。

中药质量标准是一个复杂艰巨体系［15］，但其重要性激励着科研工作者不断的探索和创新［16-17］。建立和提高夏桑菊颗粒的质量标准是为了将假药和劣药拦在流通大门之外，而目前以假乱真、以次充好的技术是与时俱进的，因此质量标准的建立与完善也是与时俱进的。本课题组接下来将从特征图谱和指纹图谱方面继续研究夏桑菊颗粒的质量标准，为建立夏桑菊颗粒的质量标准体系提供参考，达到有效控制夏桑菊颗粒质量之目的。

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