1株藏猪源鼠伤寒沙门菌的分离与鉴定

2013-09-23索朗斯珠

中国兽医杂志 2013年6期

贡嘎，查果，拉珍，索朗斯珠

（西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000）

猪沙门菌在自然界中十分普遍，是由猪霍乱沙门菌、猪伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等引起仔猪的一种传染病。本病一年四季均可发生，但以多雨潮湿季节发病较多，多与其他病毒，如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒混合感染，混合感染时导致发病率与死亡率增高［1－3］。

2012年6月份，西藏地区某藏猪养殖场的猪体温突然升高，随后呼吸困难，耳根、腹下皮肤有红色斑点等症状。病死猪剖检可见脾脏显著肿大、出血，肝、肾有不同程度的肿大、充血、出血，肺脏整个呈干酪样等病变。

1 材料与方法

1．1 病料西藏地区某藏猪养殖场病死猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结。

1．2 试验动物上海斯莱克实验动物有限公司购买10只SPF级4周龄Balb／C小鼠，雌雄各半。

1．3 主要试剂普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血平板、普通肉汤、三糖铁斜面及各生化培养基均由本实验室制备［4］。

细菌基因组DNA快速提取试剂盒，多功能DNA纯化回收试剂盒，购自美国Omega公司；2×powerTaqPCR MasterMix，购自上海东胜有限公司；感受态大肠杆菌DH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD18－T，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1．4 细菌的分离与鉴定无菌采取病死藏猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结做为病料涂片，革兰染色镜检。

无菌采集自然病死藏猪的心血、肝、脾、肺、肾、淋巴结分别接种普通平板、血平板、麦康凯琼脂平板，分别37℃培养24h，从中分离到1株疑似沙门菌的革兰阴性直杆菌。取单个菌落进行纯培养，同时进行涂片染色镜检。

取分离菌株的纯培养物接种生化培养基，设对照组。将试验管与对照管同时置37℃培养，观察结果。

PCR鉴定：引物设计根据沙门菌argT基因保守序列设计一套引物，序列如下：S1：5′－ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG－3′；S2：5′－TGTTGTCCT GCCCCTGGTAAGAGA－3′，扩增目的片段为495bp。

细菌DNA提取与PCR：提取DNA严格按试剂盒说明书进行。采用普通PCR扩增。阳性条带割胶，经纯化后连入pMD18－T载体，克隆测序。

PCR扩增条件为：95℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。

1．5 动物致病性试验试验组用18h肉汤培养物给小鼠灌胃，0．2mL／只；对照组用普通肉汤0．2 mL／只给小鼠灌胃。

1．6 药物敏感性试验用灭菌涂棒将普通肉汤培养物均匀致密地涂布于普通琼脂平板，将药敏纸片贴压于平板上，37℃培养24h，观察结果。

2 结果

2．1 镜检及分离培养镜检可见1株革兰阴性直杆菌、有鞭毛，能运动，无芽孢及荚膜；在普通平板上生长菌落细小、圆形、凸起、光滑、边缘整齐；在麦康凯琼脂平皿上，菌落细小、边缘整齐、光滑凸起；在血平板上生长大菌落、凸起、暗白色、不溶血、边缘整齐。

2．2 生化结果见表1。

表1 生化鉴定

2．3 PCR鉴定在生化鉴定的基础上，分离菌PCR扩增，扩增产物在含1%琼脂糖凝胶电泳，结果可以见到1条清晰的目的条带，大小与预期结果相符。扩增产物的测序结果在GenBank上进行序列分析比对，结果与鼠伤寒沙门菌的基因序列同源性达到100%，确定为鼠伤寒沙门菌（见图1）。

2．4 动物致病性试验 4周龄Balb／C小鼠随机分2组，每组5只，试验组小鼠灌胃菌液后的8h后发病，精神委靡、食欲下降或不食，18h开始出现死亡。剖检观察，可见脾脏显著肿大，肝脏出血，有小坏死点，肺脏有出血点、变脆，肾脏肿大。从死亡小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中均能分离出与感染细菌相似的细菌，经PCR鉴定与所分离出的菌一致。对照组小鼠仍存活。