亚急性硒中毒对雄性小鼠睾丸能量代谢及抗氧化能力的影响

刘克祥，管延杰，赵树臣，范宏刚，侯振中

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

硒是生物体必需的微量元素之一，分布广泛，主要通过食物链控制着动物的硒营养状况。研究表明，硒具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫、参与雄性激素的代谢以及拮抗多种微量元素的毒性等作用。但硒的摄入过量会导致毒性作用。本试验通过对小鼠给予过量的亚硒酸钠制作亚急性硒中毒动物模型，研究了亚急性硒中毒对小鼠睾丸能量代谢及抗氧化能力的影响，为兽医临床合理补硒和预防硒中毒提供用药参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 试验动物 体重20±2g（5～6周龄）的昆明系未交配过的健康小鼠200只（雌性40只、雄性160只）。

1．1．2 主要仪器 XHF－1内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；PS－9000705超纯水制备装置（美国Millpore科技有限公司）；752N型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1．1．3 主要试剂 亚硒酸钠（Sodium Selenite），分析纯，批号：20090313，购自上海三浦化工有限公司。1．1．4 样品的制备 将70只小鼠随机分成7个组，每组10只，利用改良寇氏法［1］计算出亚硒酸钠对小鼠的LD50＝10．8mg／kg体重。另取120只雄性昆明系小鼠按照1／5LD50（2．16mg／kg体重）、1／20LD50（0．54mg／kg体重）、1／80LD50（0．14mg／kg体重）和相同体积的生理盐水4种给药剂量随机分成高、中、低剂量组和对照组，每天上午同一时间给药，连续30d。所有小鼠分别于给药10、20、30d时分3批处死，处死后采取小鼠的睾丸组织匀浆后，离心取上清，－80℃保存。

1．2 试验方法

1．2．1 睾丸LDH活性检测 乳酸脱氢酶（LDH）能催化乳酸生成丙酮酸，与2，4－二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性环境中呈棕红色，通过比色可求出该酶的活力。

1．2．2 小鼠睾丸SOD活性检测 机体内产生的超氧阴离子自由基可氧化羟胺形成亚硝酸盐，显色剂作用下呈紫红色，当被测样品中含SOD时，则对其有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

1．2．3 小鼠睾丸MDA含量检测 采用硫代巴比妥酸法。酸性条件下脂质过氧化代谢产物丙二醛（MDA）受热后，与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成粉红色化合物，该化合物在532nm处有最大吸收峰，由此求得反应体系的MDA含量。

2 结果与分析

小鼠睾丸能量代谢及抗氧化能力 由表1可知，各个时间点各染毒组小鼠睾丸LDH活性分别与对照组比较差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。低剂量组不同时间点之间两两比较差异不显著（P≥0．05），中、高剂量组10d与20d比较差异不显著（P≥0．05），分别与30d比较差异显著（P＜0．05）。表明硒染毒后，小鼠睾丸LDH活性明显降低，随着染毒剂量的增加呈显著下降趋势，随着染毒时间的延长下降趋势不显著。

表1 不同染毒剂量与染毒时间睾丸LDH活性检测 （U／gprot）

图1 不同染毒剂量与染毒时间睾丸LDH活性比较

由表2可知，10d时，低、中剂量组小鼠睾丸SOD活性与对照组比较差异不显著（P≥0．05），高剂量组与对照组比较差异显著（P＜0．05）；20d和30d时，各染毒剂量组分别与对照组比较以及各染毒剂量组之间比较差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。各染毒剂量组不同时间点之间比较差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。表明硒染毒后，小鼠睾丸细胞SOD活性明显降低，随着染毒剂量的增加和染毒时间的延长呈显著下降趋势。

由表3可知，10d时，低、中剂量组小鼠睾丸MDA含量与对照组比较差异不显著（P≥0．05），高剂量组与对照组比较差异显著（P＜0．05）；20d和30d时，各剂量组分别与对照组比较以及各剂量组之间比较均为差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。各剂量组不同时间点之间比较均为差异极显著（P＜0．01）。表明硒染毒后，小鼠睾丸细胞MDA含量明显升高，随着染毒剂量的增加和时间的延长呈显著升高趋势。

3 讨论

乳酸脱氢酶（LDH）由生精细胞产生，广泛存在于生精小管内，动物睾丸各级生精细胞位于支持细胞紧密连接的上方，很难直接通过基膜从间质获取营养，而主要依靠自身糖酵解获取细胞所需能量，因此乳酸脱氢酶是生精细胞糖代谢生能的主要酶，它对于生精细胞的增殖分裂以及分化过程中的能量代谢都起着重要作用。若其合成减少或其活性受到抑制，将阻碍能量的供给，最终有可能导致细胞的变性或者凋亡，因此LDH的含量和活性的动态变化可作为评价生殖毒性的敏感指标之一。LDH活性还与生精过程及精子活动、获能及受精有关，可作为预测生精能力的重要指标［2］。本试验结果显示，硒染毒后，小鼠睾丸LDH活性显著降低，随着染毒剂量的增加，LDH活性呈明显的下降趋势，即呈明显的剂量效应关系，提示硒可能通过引起生精细胞的损伤而抑制LDH的分泌或其活性，也可能直接作用于LDH对其活性造成影响。LDH活性降低表明硒或其代谢产物对机体具有毒性作用，阻碍生精细胞能量供应和营养供给，影响精子的发生，使各级生精细胞数量减少。

表2 不同染毒剂量与染毒时间睾丸SOD活性检测 （U／mgprot）

表3 不同染毒剂量与染毒时间睾丸MDA含量检测 （nmol／mgprot）

超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于生物体中，是机体脂质过氧化防御系统的关键酶。其主要功能为催化生物体内超氧阴离子自由基发生歧化反应，特异性清除体内氧自由基，终止自由基连锁反应，从而保护生物膜免受自由基的攻击。SOD在防御氧自由基毒性、抗辐射损伤、预防衰老以及治疗肿瘤和炎症等方面起着重要作用，SOD活性的改变可以作为机体组织受到氧化损伤的一项敏感的生物学指标。

丙二醛（MDA）是ROS攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸（PUMA）形成的脂质过氧化反应的产物之一，可以造成组织的损伤，因此用来反映组织脂质过氧化反应的程度。MDA能够与膜脂质或蛋白上的游离氨基酸交联而改变膜的结构，氧化琉基、使酶失活，引起磷酯酰胆碱和磷酯酰丝氨酸交联，干扰膜的离子转运功能，从而干扰细胞的正常功能［3］。

赵红刚等［4］探讨亚硒酸钠对不同器官、组织SOD活性的影响，结果显示肝、肾、心等器官SOD活性随着亚硒酸钠染毒剂量的增加逐渐降低。本试验中，随着硒染毒剂量的增加，小鼠睾丸SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，各剂量组与对照组比较差异显著。该结果表明，硒能够破坏睾丸的过氧化防御系统，引起睾丸组织的脂质过氧化损伤，同时生产大量脂质过氧化物，其中的MDA促进ROS转化成非自由基性的脂类分解产物，通过链式或链式支链反应放大ROS的氧化损伤作用，使生物膜损伤更加严重［5］，最终引起细胞膜破裂、内容物释放等，造成睾丸组织结构与功能的损伤，与睾丸组织学切片结果相一致。

［1］ 沈建忠．动物毒理学［M］．北京：中国农业出版社，2002：90－94．

［2］ Sinha N，Narayan R，Saxena D K．Effect of endosuifan on the testis of growing rats［J］．Bull Environ Contam Toxieol，1997：58：79－86．

［3］ 孙存晋，张建中，段绍瑾．自由基生物学导论［M］．合肥：中国科学技术大学出版社，1999：150－156．

［4］ 赵红刚，陈贤均．硒中毒对小鼠器官蛋白质含量及SOD活性影响的实验研究［J］．环境与职业医学，2006，23（3）：262－263．

［5］ 段丽菊．甲醛致雄性小鼠的氧化损伤和雄性生殖遗传毒的研究［D］．武汉：华中师范大学，2005．