SPF雏鸡感染REV后IL－6和IFN－γmRNA表达的动态变化

陈雪锋，李恩扩，王肖祎，陈 静，胡敬东

（山东农业大学动物医学院 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安271018）

细胞因子作为一种具有多活性多功能的小分子蛋白，在机体中发挥着重要的免疫调节作用，而其产生的过多和不足则对于病理生理学很有意义［1］。

网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis，RE）是指由反转录病毒科中的网状内皮组织增生症病毒（REV）引起的一种可以侵害多种禽类的严重免疫抑制性疾病［2］，迄今对REV感染在分子水平上对细胞因子免疫调节作用的影响等尚缺乏深入研究。为进一步了解该病的发生和免疫机制，我们对1日龄SPF雏鸡人工感染REV 后主要免疫器官中IL－6和IFN－γ两种重要细胞因子的动态变化进行了初步研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试剂和仪器 SYBR Green荧光定量PCR试剂盒、DNA Marker DL－2 000等，购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR仪7500型，购自美国ABI公司；八联管，购自美国Axygen公司；TransZol Up和反转录试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

1．1．2 试验动物 1日龄SPF鸡，购自山东济南SAIS家禽科技有限公司［许可证号：SCXK（鲁）20090003）］。

1．1．3 禽网状内皮组织增生症病毒（REV），由崔治中教授惠赠。

1．1．4 引物合成 根据GenBank上登录的鸡白细胞介素6（ChIL－6）基因、鸡γ干扰素（ChIFN－γ）基因和内参核糖体蛋白亚基4（RPL4）基因序列，应用DNAStar软件设计了3对特异性引物，经BLAST分析后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。引物序列见表1。

表1 3种基因引物序列

1．2 方法

1．2．1 动物试验 120只1日龄SPF鸡随机分为2组：REV处理组和正常对照组（处理组每只腹腔注射102TCID50REV，对照组注射等量生理盐水），每组60只，饲养方式相同，每组分别于7、14、21、28、35、42、49d随机取6只剖杀（每个时间点每组随机取6只鸡），立即取脾脏、胸腺和腔上囊并置于－80℃，备用。

1．2．2 总RNA的提取及反转录 鸡的3种免疫器官总RNA提取按照TransZol Up说明书进行，反转录按照 TransScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书进行，cDNA放－20℃保存备用。

1．2．3 PCR扩增 PCR反应体系及程序以反转录合成的cDNA为模板分别扩增目的基因IL－6、IFN－γ和内参基因RPL4。依次在PCR管中加入以下试剂：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 4μL，MgCl2（25mmol／L）2μL，上下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 7．8 μL，TaqDNA polymerase 0．2μL，然后进行PCR扩增。反应条件为94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

1．2．4 IL－6和IFN－γSYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立 反应总体积为20μL，其中SYBR Premix ExTaqTM（200×）10．0μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0．4μL，上、下游引物（10 μmol／L）各0．4μL，质粒模板2．0μL，灭菌蒸馏水6．8μL。反应程序为：95℃预变性15s；95℃变性5s，60℃退火34s，扩增40个循环。为了分析SYBR Green I PCR 扩增特异性，应对扩增产物制作熔解曲线，条件为：95℃15s，60℃1min，95℃15 s，60℃15s。反应设内参RPL4基因和空白对照（去离子水代替引物及模板）。反应结束后，对获得的信号、数据进行处理，并利用配机软件进行分析，建立标准曲线和熔解曲线。

1．2．5 实时荧光定量PCR检测不同时期IL－6和IFN－γmRNA的转录水平 以纯化的cDNA为模板，内参RPL4为对照，每一时期取6个样品，每个样品重复3次，用建立的最优方法进行检测。

1．2．6 数据处理与分析 根据比较阈值法［3］计算出目的基因的相对含量，目的基因的相对含量＝2－△△Ct。注释：△△Ct＝［CtT－CtHK］X－［CtTCtHK］0，T＝待测基因；HK＝内参基因；X＝待测样本；0＝校正样本。数据采用SPSS17．0统计软件，两组试验结果采用t检验法进行分析。

2 结果与分析

2．1 IL－6、IFN－γ和内参 RPL4基因片段的 PCR扩增 IL－6、IFN－γ和RPL4基因片段的PCR产物4μL，于4%琼脂糖凝胶电泳，结果分别出现1条254bp、259bp和154bp左右的DNA带（图1），与预期大小一致。

图1 IL－6、IFN－γ和RPL4基因的PCR扩增产物电泳

2．2 IL－6、IFN－γ和 RPL4基因片段重组质粒的鉴定 对提取的重组质粒进行测序鉴定，结果三段都与GenBank上已发表的序列完全一致。

2．3 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR熔解曲线的建立

熔解曲线（图2）分析表明，该方法扩增的目的基因（IL－6和IFN－γ）和内参基因（RPL4）均具有特异性，只出现各自的单一峰，无引物二聚体或其他非特异性产物生成。

2．4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立 该方法具有较高的灵敏度，IL－6和IFN－γ的检测下限均为100copies／μL，建立的标准曲线斜率分别为－3．08（IL－6）、－3．16（IFN－γ）和－3．15（RPL4），3种基因的扩增效率均107%左右，其相关系数也均在0．99以上，符合比较阈值法相对定量分析的前提，检测所得Ct值可按比较阈值法分析。

图2 IL－6、IFN－γ和RPL4的实时荧光定量PCR熔解曲线

2．5 IL－6和IFN－γ基因荧光定量的表达水平 本试验将对照组7d时两种细胞因子基因的表达量作为参照因子，处理组及其他时期两种细胞因子基因的表达量与其相比，得到相应基因表达量的倍数，采用内参RPL4对两种细胞因子基因进行均一化处理，SPF鸡免疫器官两种细胞因子基因的相对表达情况见图3。

从图3～5中可以反映出，处理组与对照组相比，3种免疫器官的IL－6和IFN－γ基因表达量在同一时间点各自升幅虽有所不同，但总体均差异显著（P＜0．05）或极显著（P＜0．01）。

3 讨论

本试验用人工感染的方法复制禽网状内皮组织增生症，采用实时荧光定量PCR对REV感染SPF鸡胸腺、脾脏和腔上囊的IL－6、IFN－γ表达量进行了检测，结果表明，试验组IL－6、IFN－γmRNA 转录水平均明显升高（P＜0．05），我们认为这种过度表达会损害免疫器官。Y．S．Zheng等［4］在 REV 感染SPF鸡后IFN－γ分泌的高峰期时检测到了腔上囊和胸腺的显著萎缩，也支持了我们的上述观点。同时国外已有学者报道，REV感染还会引起脾细胞肿瘤坏死因子（TNF）水平明显增高，这种过高水平的TNF对免疫器官有免疫损伤作用，与免疫功能的下降密切相关［5］。

图5 腔上囊IL－6和IFN－γ基因在不同时间点的相对表达量

Kaiser等［6］研究发现，马立克病毒早期溶细胞感染期，易感鸡脾细胞中ChIL－6mRNA含量显著升高，ChIL－6的高水平转录又指示了病变的加剧，促进了淋巴瘤的发生，而抗性鸡中ChIL－6含量无变化，利于疾病的转归。同样，马立克病毒感染后鸡体内ChIFN－γ含量升高，升高程度取决于宿主的遗传背景及病毒毒力［6－7］。而我们在REV感染模型中观察到的现象显然与前述结果相似，因此有理由相信IL－6、IFN－γ作为两种重要的前炎性细胞因子在REV致病过程中发挥的作用很可能类似于它们在另一致瘤性马立克病毒感染中的作用，或者说两者有相似的变化规律。

［1］ 郑玉姝，赵 朴，赵宏坤，等．细胞因子的检测及其在鸡免疫抑制病中的应用［J］．中国家禽，2006，28（20）：96－98．

［2］ 杜 岩，崔治中．禽网状内皮组织增生病病毒感染引起的鸡群免疫抑制［J］．中国兽医学报，2001，21（2）：122－124．

［3］ Livak K，Schmittgen T．Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the Delta C（T））Method［J］．Methods，2001，25（4）：402－408．

［4］ Yu－Shu Zheng，Zhi－Zhong Cui，Hong－Kun Zhao．Effects of Reticuloendotheliosis Virus Infection and Co－infection on IFNGamma Production in SPF Chickens［J］．J Vet Med Sci，2007，69（2）：213－216．

［5］ Guillermo，Zavala．Immunosuppression Induced by Reticuloendotheliosis Virus［J］．American Association of Avian Pathologists，2008，52（1）：70－80．

［6］ Kaiser P，Underwood G，Davison F．Differential cytokine responses following Marek′s disease virus infection of chickens differing in resistance to Marek′s disease［J］．J Virol，2003，77（1）：762－768．

［7］ Parvizi P，Read L，Abdul－Careem M，etal．Cytokine gene expression in splenic CD4＋and CD8＋T cell subsets of genetically resistant and susceptible chickens infected with Marek′s disease virus［J］．Vet Immunol Immunop，2009，132（2－4）：209－217．