GM-CSF分泌型肝癌疫苗对荷瘤鼠脾血细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的影响

郭银燕 文 剑 张永臣 杨永峰

肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，以调节机体的免疫功能，达到预防和治疗肿瘤的目的。为了提高其免疫原性，常需在肿瘤疫苗中加入佐剂。灭活肿瘤细胞加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）主动免疫疗法是目前已知的肿瘤免疫疗法中最为安全和有效的方法。GM-CSF作为肿瘤疫苗免疫佐剂已在肾癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌等进行了临床试验[1～4]，并取得了一定的疗效。有研究表明能表达GM-CSF的自体肿瘤细胞经照射后能增强全身免疫反应[5]。我们制备了GM-CSF分泌型肝癌疫苗并免疫小鼠，获得了明显的抗肿瘤效果，现报道如下。

材料与方法

一、实验动物与试剂 SPF级雌性5周龄ICR小鼠，体重18～22g，购自南通大学实验动物中心。GM-CSF分泌细胞（每支0.3ml，含4×106细胞）及原代肿瘤细胞处理试剂盒购自北京博渥德生物技术有限公司。H22小鼠肝癌细胞株（每支0.1ml，至少含有1×106细胞）购于美国Sciencell公司。

二、细胞培养 在含10%灭活胎牛血清的RPMI1640（GIBCO公司）完全培养液中，37℃、5%CO2条件下培养小鼠肝癌细胞株H22细胞，经0.25%胰酶（美国Sigma公司）消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

三、GM-CSF分泌型肝癌疫苗的制备 将H22细胞株按原代肿瘤细胞处理操作说明灭活处理后与GM-CSF分泌细胞按照5∶2比例混合，其分泌GM-CSF量大于1μg/106细胞/24h。

四、肝癌细胞移植瘤动物模型制备 复苏小鼠肝癌细胞株H22，按细胞浓度1×106细胞/只注入小鼠腹腔内，接种7d形成腹水瘤后再在小鼠体内传3代后使用；取生长旺盛且无血性的腹水，在无菌条件下制成2×107/ml的细胞悬液，以2×106细胞/0.1ml/只接种于3组小鼠右前肢皮下。4天后，开始在右侧背部皮下进行免疫治疗。将肝癌细胞移植瘤动物随机分成三组（每组 5只），即 1，H22-GM-CSF组：接种GM-CSF分泌型H22肝癌疫苗，每只“H22肿瘤细胞”0.1ml和“GM-CSF分泌细胞”30μl，融合后混合，再注射；2，H22组：接种H22肝癌细胞瘤苗，每只“H22肿瘤细胞”0.1ml；3，PBS组：接种 PBS，每只 0.1ml。每周免疫注射1次，共3次。免疫小鼠后每3d用卡尺测量一次肿瘤体积。肿瘤体积（tumor volume，TV）的计算公式为：TV=1/2×a×b2。其中a和b分别表示长和宽，取均值，描绘各组荷瘤小鼠肿瘤生长曲线。

五、小鼠脾血CTL杀伤活性检测 分别于免疫前及末次免疫后1周，处死小鼠，取其脾细胞，制备成效应细胞悬液，以小鼠肝癌H22细胞作为靶细胞进行重复刺激，观察效应细胞对靶细胞的杀伤比率。采用细胞增殖计数法（cell counting kit-8，CCK-8）法，将对数生长期小鼠肝癌细胞H22，以1×106/ml接种于96孔培养板中，每孔 100μl，按效 /靶比 50:1、25:1和5:1的比例分别加入脾脏细胞悬液100μl，每组设立3个复孔，同时设立靶细胞对照组、效应细胞组和空白对照组。在37℃、5%CO2培养箱培养4h后，每孔分别加入CCK-8试剂10μl，培养箱中孵育4h，使用酶联免疫分析仪检测各孔在波长450nm处的吸光度。按下列公式计算CTL杀伤活性，即杀伤活性（%）=[1-（效靶混合细胞的平均A值-效应细胞的平均A值）/对照孔的平均A值]×100%。

结果

一、荷瘤鼠肿瘤体积的变化 在免疫小鼠后21天，H22-GM-CSF组、H22组和PBS组小鼠肿瘤体积分别为 0.63±0.05mm3、1.47±0.75mm3和 1.79±0.34 mm3（P<0.05，图1）。

图1 各组小鼠肿瘤体积的变化

二、小鼠脾CTL杀伤活性的变化 小鼠在免疫前，当效/靶比为5∶1、25∶1和50∶1时，CTL杀伤活性分别为1.87±1.32%、5.81±2.82%和14.12±2.60%。在GM-CSF-H22免疫后，小鼠CTL杀伤活性显著高于其他两组（表1）。

表1 各组小鼠脾CTL杀伤活性（%，）的比较

表1 各组小鼠脾CTL杀伤活性（%，）的比较

与PBS组和H22组比，①P<0.01

效：靶=5:1 效：靶=25:1 效：靶=50:1 GM-CSF-H22 12.1±3.2① 22.2±7.1① 60±6.1①H22 10.2±4.3 9.0±1.5 17.4±0.9 PBS 3.4±1.9 5.6±0.9 12.2±0.6

讨论

GM-CSF是一种人体内天然存在的23kD糖蛋白，具有刺激造血系统和免疫系统细胞增殖、分化和活化作用的细胞因子。GM-CSF的主要作用是对粒细胞系和单核细胞系细胞的维持存活、促进生长、诱导分化和增强功能等。GM-CSF可维持造血前体细胞和成熟血细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核/巨噬细胞）的存活；能够促进造血前体细胞（包括粒细胞、单核细胞和巨核细胞等前体细胞）增殖分化。GM-CSF能增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，还能增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化作用。GM-CSF诱导树突状细胞成熟和功能性分布的作用已受到广泛关注，有可能被应用于免疫治疗中诱导抗原提呈细胞[6]。

CTL表面的TCR对靶抗原的识别及其对靶细胞的杀伤效应具有高度特异性，它只杀伤表面带有特异性肿瘤抗原和MHC-I类分子的靶细胞[7]。CTL细胞数与被杀伤的肿瘤细胞数呈正相关[8]。本实验对小鼠脾细胞进行瘤细胞-脾细胞混合培养，其目的是使CTL进一步活化，因为活化CTL需要两种不同的信号。一类信号来自TCR特异性识别靶细胞膜上MHC-I类分子-抗原肽复合物，并通过CD3分子参与抗原识别信号的传递；第二信号来自于CTL膜表面各种辅助分子如CD28、CD2、LFA-1和靶细胞表面相应配体分子（如B7）。活化的CTL还需在活化的CD4+Th1细胞分泌的IL-2等细胞因子的作用下，才能分化为效应性CTL。在这两种信号作用下就触发了CTL细胞杀伤靶细胞效应。其细胞毒效应机制主要有两种[8]，①细胞裂解性杀伤：CTL分泌诸如穿孔素一类的介质损伤靶细胞膜，颗粒酶可经由穿孔素在靶细胞膜上构筑的小孔进入靶细胞，诱导靶细胞的凋亡。在CTL-靶细胞相互接触的区域形成密封的袋，CTL胞内颗粒由高尔基体区向接触区移动并释放颗粒内的穿孔素和粒酶，穿孔素导致靶细胞膜形成许多跨膜小管，粒酶通过这些小孔进入细胞最终引起细胞肿胀、破裂；②诱导细胞凋亡:即CTL表达的Fas配体与肿瘤细胞表达的Fas受体结合，从而启动肿瘤细胞凋亡。此外，细胞通过分泌肿瘤坏死因子、颗粒酶以进一步破坏靶细胞。对某一个靶细胞攻击后，CTL仍然保持完整并具有活性，能够继续攻击其它靶细胞。本实验发现，在瘤苗接种后H22-GM-CSF肝癌细胞瘤苗组效应细胞的杀伤能力增加明显，远高于其他各组，并且随着效靶比增大，CTL杀伤活性增强。可以推断该疫苗免疫效果主要通过直接活化CD8+T细胞而产生。

GM-CSF分泌型肝癌疫苗治疗H22移植性肝癌荷瘤鼠使肿瘤生长得到明显抑制，荷瘤鼠外周血CTL在体外对同种肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤活性。

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