GMPase基因对烟草开花的调控研究

沈 毅，赵 根，李 莉，彭彩娥

(1.浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州 310058;2.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000;3.浙江大学湖州市南太湖现代农业科技推广中心，浙江湖州 313000)

烟草 (Nicotiana tabacum)是茄科烟草属一年生草本自花授粉植物，天然杂交率仅1%～3%，一般在花冠裂开前已完成授粉。利用基因调控和转基因研究基因调控烟草开花的问题，不仅可缩短烟草开花时间，对烟草行业的发展也具有重要意义。

GMPase是调控烟草中抗坏血酸 (AsA)的重要基因，其过量表达和抑制表达对烟草叶片中氧化型和还原型AsA具有较大影响，从而影响到烟草的花期。AsA又称Vc，是含有内脂结构的多元醇类，其特点是具有可解离出H+的烯醇式羟基，因而其水溶液有较强的酸性。AsA在动植物体中具有重要的抗氧化功能和代谢功能，人体无法自身合成，新鲜蔬菜水果是人体摄入的重要来源［1］。

AsA普遍存在于植物体组织中，是一种高丰度小分子抗氧化物质，可直接与超氧自由基(·)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)等发生活性氧反应，从而达到植物体抗氧化，在抗氧化胁迫中具有重要作用［2－5］。AsA除了参与植物抗氧化外，还具有其他许多特殊的功能:参与植物细胞壁的合成、伸长和交联;调节基因的转录翻译;调节细胞氧化还原平衡，是一种重要的氧化还原缓冲剂;作为一些酶的辅酶，调节酶的活性;调节细胞的分裂和伸长。AsA的这些重要生理功能是与其氧化还原状态以及生物合成、代谢、再生和转运的相关酶类活性的变化密切相关的［2，6－7］。

AsA通过参与植物细胞内的相关氧化还原反应，从而达到植物细胞的抗氧化作用。AsA在细胞内主要由抗坏血酸氧化酶 (ascorbate oxidase，AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)催化。APX以AsA为电子供体，将H2O2还原为H2O，同时将AsA氧化为单脱氢抗坏血酸MDHA;MDHA以细胞色素b为电子供体，在MDHA还原酶 (MDHAR)的作用下还原为AsA，也可进一步生成脱氢抗坏血酸 DHA。而DHA在DHA还原酶的催化下，利用胱光甘肽为电子供体，通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环还原成AsA，并最终使 H2O2得以清除［3－4，8］，氧化型谷胱甘肽在谷胱甘肽还原酶的催化下，用NADPH为电子供体得以还原。细胞壁内的AsA通过质膜运载体，以易化扩散方式与DHA交换而来，并在AO的作用下被氧化为MDHA，这样产生的MDHA可能被质膜Cyt b系统还原;而细胞质内的AsA氧化所产生的MDHA有两种途径:进入胞质内的抗坏血酸-谷胱甘肽循环，或者以NADH为电子供体被定位于质膜内侧的MDHAR催化还原为AsA［9］。

本试验是建立在陈坤明等［5］对植物AsA的合成等研究的基础上，先将野生烟草经转基因得到试验用转基因烟草，再将野生烟草和转基因烟草同时播种生长，在相同环境下，测量其生长指标，并在特定阶段，测定其叶片中过氧化物酶 (POD)和丙二醛 (MDA)含量，来研究GMPase基因对烟草开花的影响。

1 材料与方法

以野生烟草为对照，以转基因T1-05和T1-15烟草为试验烟草。播种培养后，测其株高、茎粗、叶面积、叶表面情况等生长指标。将野生型烟草和T1-05，T1-15转基因型烟草经4℃低温和40℃高温处理后，测定其POD含量的变化，及4℃低温对MDA含量的影响。

2 结果与分析

2.1 生长

3种试材播种后，置于人工气候试验室内培养，每种烟草取16棵，每隔1周测量其生长指标1次，共5周，再取平均数 (表1)。数据显示，野生烟草在株高上比转基因T1-05，T1-15烟草矮得多，而野生烟草几乎没有茎，叶片直接从底部生长，无法测量其茎粗，而在叶面积上明显比转基因T1-05，T1-15烟草大很多，叶表面野生无毛和褶皱。而T1-05和T1-15转基因烟草在株高、茎粗和叶面积上差异不大，叶表面随之开始有毛和褶皱。T1-05和T1-15转基因烟草的节间显著长于CK烟草，且叶片较薄而小，并出现早衰的现象。

表1 野生烟草和转基因烟草的表型差异

2.2 POD含量

以POD为代表的抗氧化酶系统和以AsA为代表的抗氧化剂组成的抗氧化系统对植物体内活性氧(ROS)水平起着精密的调控作用，从而将活性氧控制在细胞可忍耐的水平。

野生型和T1-05，T1-15转基因型烟草材料经低温和高温处理后其POD含量发生明显变化 (图1－2)。

图1 低温处理对烟草POD含量的影响

图2 高温处理对烟草POD含量的影响

由图1可知，随着低温处理，野生型烟草的POD含量迅速下降，24 h后基本平稳;而T1-05和T1-15烟草的POD含量开始表现为下降，24 h后呈上升趋势。说明野生型烟草在0，24 h低温处理的抗逆性优于T1-05和T1-15转基因型烟草，但T1-05和T1-15在24 h后抗逆性开始反弹。

由图2可知，高温处理破坏了酶活性，处理时间越长，破坏程度越高，POD含量越低。但总体而言，野生型烟草的POD含量比T1-05和T1-15转基因的高，说明总体上野生型烟草抗高温优于T1-05和T1-15转基因型烟草。

2.3 MDA含量

植物体在不利的生长环境下受到伤害或者衰老，都与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关。产物中的MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，可通过对其含量的测定来显示植物膜脂过氧化的程度，间接测定膜系统受损情况及抗逆性。

野生型和T1-05，T1-15转基因型烟草经4℃低温处理后，其MDA含量发生明显变化 (图3)。

图3 低温处理对烟草MDA含量的影响

由图3可知，处理24 h后，3种烟草抗逆性相当;12和48 h时，T1-05和T1-15转基因烟草抗逆性优于野生型烟草;36 h时，野生烟草抗逆性高于T1-05和T1-15。结果表明，随着低温处理时间的延长，膜系统受损一定程度后，就不再受破坏;野生型烟草的恢复能力和抗逆性优于T1-05和T1-15转基因烟草。

3 小结与讨论

GMPase基因是植物合成AsA的首个关键酶基因，催化产物GDP-甘露糖可用于合成植物细胞壁的碳水化合物，在肽链合成的同时或合成后，还可用于糖链被接到肽链上特定的糖基化位点 (蛋白糖基化)。GMPase基因能提高体内AsA含量，可增强植物体的抗胁迫能力［10］。

与野生型烟草相比，转基因烟草叶片AsA含量降低了30%～40%，表现出与野生烟草不同的表型。转基因烟草植株在组培过程中就开始开花，在7～8片叶时全部开花，而野生烟草生长至25～28片叶时才开始开花，转基因烟草开花时间比野生烟草提前近1个月。在7～8片叶时，转基因烟草的节间显著长于野生烟草，叶片薄且小，并出现早衰现象。

GMPase基因的抑制表达明显降低了转基因烟草的自身抗氧化能力，在4℃低温和40℃高温胁迫下，T1-05和 T1-15转基因烟草叶片的 SOD、APX活性显著低于野生烟草，而其叶片的MDA和H2O2含量大大超过野生烟草。上述结果证明了GMPase基因在植物体合成AsA过程中起关键作用，虽然GMPase不是清除活性氧的抗氧化酶，但GMPase基因的表达却与植物的抗氧化能力密切相关［10］。

通过对烟草的植株生理性状、POD含量、MDA含量的测定表明，野生烟草在抗逆性方面优于转基因烟草，GMPase基因能有效地控制AsA的合成，从而实现对烟草花期的有效调控。

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