林蛙卵提取高F值低聚肽混合物的酶解方法

吕集，刘娜，燕俊青，邬纯鑫，焉再华，杜景新

（吉林省通化市中心医院吉林省通化市林蛙研究所，吉林通化 134001）

林蛙卵提取高F值低聚肽混合物的酶解方法

吕集，刘娜，燕俊青，邬纯鑫，焉再华，杜景新

（吉林省通化市中心医院吉林省通化市林蛙研究所，吉林通化 134001）

摘 要：以林蛙卵渣作为原料，通过酶解的方法来制备高F值低聚肽，探讨短肽复合酶对林蛙卵渣中的蛋白质水解进程曲线。结果表明其最适条件为，底物浓度为3%（g/100 mL）、温度为50℃、pH8.0、酶添加浓度为2%（质量分数）、时间240 min。然后水解液经冷冻干燥得到F值20.18的低聚肽。

关键词：林蛙卵；高F值低聚肽；酶解

高F值低聚肽混合物是2个～10个氨基酸组成的混合小肽体系，在该混合物中，支链氨基酸（BCAA：Val、Ile、Leu）与芳香族氨基酸（AAA：Tyr、Phe）含量的克分子数比值称为F值（fischer ratio），其F值应在20以上[1]。

高F值低聚肽是一种具有高支链氨基酸含量和低芳香族氨基酸含量组成的小肽体系，能够防治或减轻肝性脑病的功效[2]、可以有效的补充膳食蛋白、改善营养状态[3]；而且具有抗疲劳的功能[4]。因此得到了食品与医药界的关注。

近几年来，国内外不少学者对其进行了研究，并取得了一定的研究进展。1976年，M.Yamashita等首次用胃蛋白酶与链酶蛋白酶，从鱼蛋白和大豆分离蛋白中，制取了低苯丙氨酸含量的低聚肽混合物[5]；1990年，T.Shinya等采用嗜碱蛋白酶和肌动蛋白酶，降解玉米醇溶蛋白研制出无苦味的高F值低聚肽，F值为20.47[5]；赵丰丽等以米糟蛋白为原料，利用双酶水解法制备了高F值低聚肽，F值为24.80[6]；郑慧娜等以马氏珠母贝肉为原料，制备高F值寡肽的工艺条件进行了优化，并研究了其体外抗氧化作用[7]；周敏华等酶解牡蛎肉制备高F值寡肽，F值大于20[8]；赵珊珊等将魔芋飞粉制备成高F值寡肽[9]。这些研究的原料涉及动植物蛋白，说明动植物蛋白均可提取高F值低聚肽。

本实验以干燥的林蛙卵经螺旋压榨机，经压榨后，过滤得油制备卵油用；而滤渣含蛋白质60%以上，所以将其作为原料制备低聚肽，采用短肽复合酶对其进行水解，制备林蛙卵高F值低聚肽。本文重点探讨短肽复合酶对林蛙卵渣中蛋白质的水解进程，为林蛙卵的进一步深加工，提供生产技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

林蛙卵渣（得到林蛙卵油后的滤渣）、短肽复合酶（130 000 IU/g）（北京市宏润宝顺科技有限公司）、其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型酸度计：雷磁分析仪器厂；DL5M型低温离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；恒温水浴锅：金坛市江南仪器厂；FD-4型冷冻干燥机：北京博医康试验仪器有限公司；氨基酸自动分析仪：日立；RE-52CS旋转蒸发仪：上海比朗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量的测定

采用半微量凯氏定氮法。

1.3.2 林蛙卵渣高F值低聚肽的制备工艺流程

林蛙卵油滤渣→短肽复合酶酶解→灭酶（95℃，15 min）→离心（3 000 r/min，30 min）→上清液→浓缩→冷冻干燥→林蛙卵渣高F值低聚肽

1.3.3 林蛙卵渣高F值低聚肽氨基酸组成测定

用氨基酸自动分析仪进行分析。

1.3.4 水解度（DH%）测定[10]

在pH 7.0～9.0条件下采用简易的pH-stat法，水解度计算公式：水解度DH%=B（Mb）（1/A）（1/MP）（1/htot）×100

其中：B为NaOH的体积，mL；Mb为NaOH的浓度，（mol/L）；A为α-氨基的解离常数；MP为蛋白质的质量，g；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，本实验中取htot=8.0[11]。

2 结果与分析

2.1 短肽复合酶水解林蛙卵渣过程中酶解条件对水解度的影响

2.1.1 底物浓度对水解度的影响

底物浓度对水解度的影响，见图1。

从图1可以看出，当底物浓度在0.5%～3%（g/100mL）时，随着底物浓度的增加，水解度呈现明显增大的趋势。但是当底物浓度大于3%时，水解度增大的趋势消失，有下降的状态。这有可能是因为当底物浓度过高时，不利于短肽复合酶与蛋白质的水解，影响其水解度。所以，我们选用底物浓度为3%。

2.1.2 温度对水解度的影响

温度对水解度的影响，见图2。

图1 短肽复合酶在不同底物浓度下水解进程曲线Fig.1 Curve of the enzymatic hydrolysis process under different substrate concentration

图2 短肽复合酶在不同温度下水解进程曲线Fig.2 Curve of the enzymatic hydrolysis process at different temperature

从图2中可以看出，在35℃时水解度最低；随着温度的升高，水解度呈明显增加的趋势，在45℃～50℃之间，水解度变化较大，在60℃时，水解度开始有下降的趋势，这有可能是因为当温度升高至一定时，酶开始发生变性，影响了酶与蛋白质的水解反应。所以，我们选择50℃左右的温度为最适温度。

2.1.3 pH对水解度的影响

pH对水解度的影响，见图3。

图3 短肽复合酶在不同pH下水解进程曲线Fig.3 Curve of the enzymatic hydrolysis process at different pH

从图3可以看出，开始时，随着溶液的pH逐渐升高，短肽复合酶对底物的水解度也呈增大趋势，水解度程度不断增加；而当pH达到8.5时，水解程度与pH8.0的水解度相似，不再升高；当pH达到9.0时，水解度呈现下降趋势，这有可能是高pH对短肽复合酶的活性中心产生影响造成的。所以，我们选择pH 8.0～8.5之间的水解液。

2.1.4 酶添加浓度对水解度的影响

酶添加浓度对水解度的影响，见图4。

图4 短肽复合酶在不同酶添加浓度下水解进程曲线Fig.4 Curve of the enzymatic hydrolysis process in different concentration of enzyme addition

从图4中可以看出，随着酶添加浓度的增加，短肽复合酶水解林蛙卵渣的水解速度加快。当酶添加浓度在0.5%～2%时，水解度增加很快；当酶添加浓度在2%～7%时，水解度缓慢增加，不是特别快；而2%的酶添加浓度与3%～7%酶添加浓度的水解度很接近，从试验成本考虑，我们选择酶添加浓度为2%作为反应条件。

2.2 林蛙卵渣F值的测定

采用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成的测定，得到F值20.18。

2.3 林蛙卵高F值低聚肽混合物得率的计算

3 结论

1）综合上述条件，低聚肽的制备方法：精密称取卵渣（底物），置于搪瓷反应釜中，底物浓度为3%，搅拌均匀，加温50℃，调pH为8.0后，加入底物的2%短肽复合酶，水解240 min，再加温至95℃，维持15 min后，过滤，取其滤液冷冻干燥，粉碎即得高F值低聚肽混合物，得率56%左右。

2）得到的林蛙卵渣低聚肽的F值达到20.18。

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[1]Fischer J E.The utilization of BCCA in the treatment coma[A].In:Capocaccia L,Fischer J E,Rossi-fanelli F.Hepatic Encephalopathy in Chronic Liver Failure[C].New York:Plenum,1984(3):11-21

[2]谷文英.肝性脑病防治肽-高F值低聚肽的研究[J].中国食品添加剂,2000(2):69-73

[3]Shin-ya Tanimoto.Enzymatic Modification of Zeim to Produce a Non-bitter Peptide Fraction with a Very High Fischer Ration for Patients With Hepaeic Encephalopathy[J].Agric Biol Chem,1191,55(4):1119-1123

[4]王海波,李文亮,张铁华,等.酶法制备玉米高F值低聚肽及其抗疲劳功能评价[J].现代食品科技,2006,22(4):37-38

[5]郑建仙.功能性食品生物技术[M].北京:中国轻工业出版社,2004:271-273

[6]赵丰丽,麻维华.米糟蛋白酶解制备高F值寡肽的研究[J].中国酿造,2009,204(3):96-99

[7]郑惠娜,章朝桦,吉宏武,等.马氏珠母贝高F值寡肽体外抗氧化研究[J].食品与机械,2010,26(6):63-66

[8]周敏华,章超桦,曾少葵,等.酶解牡蛎肉制备高F值寡肽的研究[J].现代食品科技,2009,25(7):751-755

[9]赵珊珊,干信.酶解魔芋飞粉制备高F值寡肽最佳工艺条件的研究[J].生物技术,2006,16(3):67-69

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[11]王璋,许时婴,汤坚.食品化学[M].北京:中国轻工业出版社,2003:268-270

Preparation of Oligo-peptides with High Fischer Ratio by Enzymatic Hydrolysis of Eggs of Rana Temporaria Chensinensis

LÜ Ji， LIU Na，YAN Jun-qing， WU Chun-xin，YAN Zai-hua， DU Jing-xin
（The Central Hospital of Tonghua， The Rana Research of Tonghua， Tonghua 134001，Jilin，China）

Abstract：In order to prepare oligo-peptides with high Fischer ratio from eggs of Rana temporaria chensinensis through enzymatic hydrolysis.The enzyme hydrolysis of Eggs of Rana temporaria chensinensis in the process of curve was investigated.The results showed that the optimal hydrolysis conditions were 3%（g/100 mL）substrate concentration，reaction temperature at 50℃，pH 8.0，2%（g/g）enzyme amount and 240 min reaction for hydrolysis.Then the oligo-peptides were by freeze-drying，the final oligo-petedes revealed the Fischer Ratio 20.18.

Key words：Eggs of Rana temporaria chensinensis； high Fischer ratio oligo-peptides； enzymatic hydrolysis

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.07.031

吕集（1957—），男（汉），主任医师，硕士研究生，研究方向：长白山野生动植物研究。

2012-07-20