响应曲面法优化板栗酶解工艺研究

张乐+王赵改+杨慧+王晓敏+史冠莹

摘    要：以板栗为原料研究了板栗浆的酶解工艺，通过单因素试验，对影响板栗酶解工艺的因素酶加量、料液比、温度、时间、pH值进行研究。根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析建立还原糖含量的二次多项式数学模型，确定了影响因素依次为加酶量>温度>时间>pH，得到的最佳酶解工艺条件为α-淀粉酶的添加量0.3%，料液比（g∶mL）1∶4，温度65 ℃，pH值 6.5，酶解时间60 min，还原糖含量（DE值）可达14.56%。

关键词：板栗;酶解;还原糖;响应曲面法

中图分类号：S664.2     文献标识码：A    DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.012

Optimization of Enzymolysis Technology of Chestnut by Response Surface Methodology

ZHANG Le， WANG Zhao-gai， YANG Hui， WANG Xiao-min， SHI Guan-ying

（Institute of Agricultural Products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou， Henan 450008， China）

Abstract： The enzymolysis technology of chestnut was investigated. The influencing factors of enzymatic hydrolysis technology of chestnut including dosage of enzyme， ratio of solid， temperature， time， pH were studied. Based on the result of the single factor experiment， the quadratic polynomial model of the reducing sugar content by using Box-Behnken design and response surface methodology was designed. Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：dosage of enzyme > temperature > time > pH value. The optimum hydrolytic parameters obtained from response surface analysis were as follows： the dosage of the α-amylase 0.3%， solid-liquid 1∶4， temperature 65 ℃， pH value 6.5， enzymolysis time 60 min. Under the optimized conditions， the actual reducing sugar content（DE value） was 14.56%.

Key words： chestnut;enzymolysis;reducing sugar;response surface methodology

板栗[Castanea mollissima Blume]也称为栗子、中国板栗，是壳斗科、栗属、坚果类植物，在中国已有3 000余年栽培历史[1]。板栗淀粉含量高达到70%左右，与粮谷类相当，还含有蛋白质、脂肪、B族维生素等多种营养素，对冠心病、动脉硬化等疾病有较好药用价值，素有“铁杆庄稼”“干果之王”的美称[2-3]。我国是世界上最大的板栗生产国，在20多个省均有栽培，栽培面积111万hm2，年产量100万t，占全球产量的70%[4]。由于板栗在贮藏过程中容易出现霉烂、发芽、生虫等问题，不宜久藏。另外我国板栗多以生栗原料销售为主，加工量少，加工转化率仅为20%～30%，而发达国家为90%～95%[5]。板栗加工主要集中在初加工如糖炒栗子，深加工产品以板栗罐头为主，品种较少，科技含量不高，加工技术比较落后，生产效率低[6]。因此，迫切需要提高板栗产品的精深加工和综合利用能力，开发各种优质的深加工新产品。

板栗果仁中淀粉含量高，使板栗饮料类制品在加工过程中溶解性差，常易产生固液分离，造成饮料分层、沉淀现象，同时易发生褐变、香味流失等问题[7]。在板栗浆中加入α-淀粉酶进行酶解，可切断一些枝条使淀粉网囊松开，降低粘稠度;还可将淀粉水解成为低分子的糊精和可溶性糖类，提高其溶解性和甜度;另外由于酶的专一性，这样仅作用于淀粉类物质，可以完整保持板栗的原有风味物质和香气成分[8]，从而有效地解决上述问题，对板栗的深度加工和更高层次的开发利用有着重要的意义。已有研究报道采用生物酶解技术，制备了马铃薯等高淀粉含量的固体饮料[9]，这为板栗固体饮料加工提供了一定的借鉴方法。本研究针对速溶板栗粉生产过程中的酶解工艺这个难点进行重点研究，优化板栗浆的酶解工艺条件，以期为板栗制品的后续制作加工奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

鲜板栗原料品种为大板红，由河北美可多食品有限公司提供。α-淀粉酶（酶活3 700 U·g-1），购于北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠等购于国药化学试剂有限公司，分析纯;重蒸酚购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HHS型数显式电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司;JYL-C022E型九阳料理机，九阳股份有限责任公司;NUⅡ-10T型实验室（超）纯水机，南京优普—实验室纯水处理系统;H1850R型台式高速冷冻离心机，湖南长沙湘仪实验室仪器有限公司;genesys10suv紫外分光分光度计，赛默飞世尔科技; ME204E型万分天平，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 板栗酶解工艺 将板栗脱壳、去衣、切片，称取板栗片按一定料液比打浆，在90 ℃恒温水浴糊化20 min，调pH值为酶的适宜值，加酶，一定温度下酶解一定时间后，沸水浴灭酶5 min，冷却后转移至离心管中，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，测定还原糖含量，表示水解度。以未酶解为对照CK。

1.3.2 还原糖测定 采用 3、5-二硝基水杨酸比色法[10]。

（1）葡萄糖标准曲线绘制。分别吸取1 mg·mL-1的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL刻度试管中，分别加水补至2 mL，再加入1.5 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴中加热5 min取出，冷却至室温，用蒸馏水补至10 mL，混匀，540 nm 波长下比色测定。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘出标准曲线，得回归方程y=1.408 2x 0.096 8，相关系数R2=0.999 4。

（2）样液测定。吸取酶解离心后上清液0.2 mL和1.5 mL DNS显色剂，加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。依据标准曲线得出的浓度及稀释倍数，计算还原糖含量。

1.3.3 酶解工艺单因素试验设计 在其他条件一致时，改变一个因素，分别研究酶加量0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%;pH值 5.5，6.0，6.5，7.0， 7.5;酶反应时间20，40，60，80，100 min;酶反应温度50，55，60，65，70 ℃;料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7对酶解效果的影响。

1.3.4 响应曲面试验设计 在单因素试验基础上，确定料液比为1∶4，以酶加量、温度、时间、pH值为自变量，还原糖含量为响应（Y），依据Box-Behnken中心组合试验的设计原理[11]，采用4因素3水平的响应面分析法，建立数学模型。自变量因素水平及编码见表1。

1.3.5 数据分析 采用Origin 8.0 软件进行数据处理和绘图;通过Design-Expert.8.05b 软件进行响应曲面模型建立和分析。

2 结果与分析

2.1 酶解效果影响因素研究

2.1.1 反应时间对酶解程度的影响 不同反应时间对酶解程度的影响结果见图1。由图1可以看出，在反应初期，随着时间的延长，还原糖含量增加较快，有显著差异（P<0.05），到60 min时达最大，之后随时间的延长而还原糖含量趋于平稳并略有下降。这是因为随着时间的延长，酶活力得到充分利用，酶解反应进行的比较完全;而随着时间的延长，还原糖含量下降，可能是因为反应产物的积累抑制了酶的活力。故酶解时间控制在60 min左右为宜。

2.1.2 pH值对酶解程度的影响 不同pH值对酶解程度的影响结果见图 2。由图2以看出，当板栗浆pH值在5.0～6.0 时还原糖含量随pH值的增大而逐渐增大且差异显著（P<0.05），pH值为6时达最大，之后随pH值的增大还原糖含量呈下降趋势。酶活力受pH值影响较大，在最适pH值下催化反应的速率最高，这是因为pH 值会影响底物和酶的构象，从而影响酶的活力及其与底物的结合[12]。

2.1.3 酶加量对酶解程度的影响 不同酶加量对酶解程度的影响结果见图 3。由图3可以看出，还原糖含量随酶加量的增大而逐渐增大，当酶加量为0.3%时达最大。随着提取液中酶浓度升高，与底物的接触面积增大，酶解反应速率升高。酶加量低于0.3%时，底物中的酶未饱和，故还原糖含量在增加。当酶浓度达到过饱和时，底物浓度相对较低，酶与底物竞争，会对酶产生抑制作用，故其后增加酶加量时还原糖含量并未增加。

2.1.4 温度对酶解程度的影响 不同温度对酶解程度的影响结果见图 4。由图4可知，还原糖含量随温度的升高而逐渐增大，65 ℃时达最大，之后随温度的升高而还原糖含量略有下降。这是因为在一定温度范围内，温度升高，酶活性增强、反应速度加快，但当温度升高超过酶作用的适宜温度时，能使酶活性降低，还原糖含量下降。

2.1.5 料液比对酶解程度的影响 不同料液比对酶解程度的影响结果见图5。由图5可知，随着料液比的升高，还原糖含量逐渐增加，当料液比为1∶4时还原糖含量达最大，随后呈略微下降趋势。较低的物料浓度有助于质量扩散作用的增强，但液料比过大会造成溶剂和能源的浪费，且会给后续操作过程带来负担。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归方程的建立与方差分析 根据单因素试验结果，以酶加量、pH值、温度和时间作为自变量，以板栗浆酶解后还原糖含量作为响应值（Y），响应曲面试验设计及结果见表2。

采用Design Expert 8.0.5软件对试验结果进行分析，得到板栗浆酶解后还原糖含量%（Y）与酶加量（A）、pH值（B）、温度（C）和时间（D）4个因素的数学回归模型如下：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。

对该回归模型进行方差分析，结果如表3所示。

由表3可知，该模型的F=22.33，P<0.000 1，表明该模型有意义且达到极显著水平（P<0.01）。决定系数R2为0.957 1，说明该模型的拟合性较好，可以用此模型对板栗浆酶解还原糖含量进行分析和预测。由表3还可以看出，A、AB、CD、A2、B2、C2、D2对还原糖含量的影响显著。由F检验得到因子贡献率为：A>C>D>B，即酶加量>温度>时间>pH值。

2.2.2 单因素效应分析 进一步分析试验中各因素对还原糖含量的影响，对模型进行降维处理，即固定任意3个因素于0水平，得到各因素与还原糖含量的效应方程，单因素效应曲线如图6。由图6可知，各因素对还原糖含量的影响均呈现先升高后降低的趋势，并且A（酶加量）变化幅度最大，说明酶加量对还原糖含量的影响最大。各曲线的变化趋势与上文单因素试验结果吻合，故说明建立的数学模型是合适的。

2.2.3 交互作用分析 方差分析结果表明， AC、AD、BC、BD无明显交互作用，AB、CD交互作用显著，即酶加量与pH值间的交互作用对还原糖含量有显著影响;温度与时间的交互作用对还原糖含量有显著影响。响应曲面和等高线如图7、图8所示。

从图7可以看出，当酶加量一定，pH值在5.5至6.5范围内，还原糖含量先显著增大，达到最大值后又开始慢慢减小;当pH值一定时，酶加量在0.2至0.4之间，还原糖含量先明显增大，达到最大之后又开始慢慢减小。由等高线图形可以看出，椭圆形明显，二者的交互作用显著。

从图8可以看出，当温度一定，时间在40 min至80 min范围内，还原糖含量先缓慢增大，达到最大值后又开始慢慢减小;当时间一定时，温度在60 ℃至70 ℃之间，还原糖含量先明显增大，达到最大之后明显减小。由等高线图形可以看出，椭圆形明显，二者的交互作用显著。

2.2.4 回归模型验证 由 Design-Expert.8.0.5b软件对模型进行典型性分析结果表明，最佳酶解工艺条件为：酶加量0.31%、pH值 5.99、温度65.24 ℃、时间59.75 min，还原糖含量的理论值为14.58%。根据实际操作的容易程度，把条件修正为酶加量0.3%、pH 值6.00、温度65 ℃、时间60 min，实测值为14.56 %，相对偏差0.14%，可见该模型能较好地反映酶解的还原糖含量条件。

3 结  论

本文对板栗浆的酶解工艺进行研究，首先对影响酶解工艺的因素酶加量、料液比、温度、时间、pH值进行了研究，在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析建立了回归方程：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。通过方差分析和失拟项分析，证明该模型拟合度较好。由F检验得到因子贡献率为酶加量>温度>时间>pH值。利用优化模型得到最佳提取条件为酶加量0.3%、pH值6、温度65 ℃、时间60 min，还原糖含量可达14.56%。为板栗的酶解工艺提供了理论依据，为板栗制品的加工奠定了理论基础。

参考文献：

[1] 耿建暖. 板栗加工中不同去皮工艺对褐变的影响比较研究[J]. 食品工业， 2013，34 （8）：54-56.

[2] 林顺顺， 祝美云， 张建威. 中国板栗的研发现状和前景[J]. 农产品加工： 学刊 （下）， 2010 （12）： 74-76.

[3] 李瑶瑶. 板栗红枣的营养价值及复合饮料的发展前景[J].中国果菜，2014， 34（6）： 44-47.

[4] 秦岭. 中国板栗资源和栗疫病菌株的遗传多样性及板栗对疫病菌的抗性研究[D]. 北京：中国农业大学，2001.

[5] 蔡荣， 虢佳花， 祁春节. 板栗产业发展现状问题与对策[J]. 北方果树， 2008 （4）： 1-3.

[6] 茅林春.板栗加工的技术难题及其对策[J].食品科技，2000（1）：24-25.

[7] 李琴，袁琳琳，朱科学，等. 速溶板栗粉的研制[J]. 食品与发酵工业，2007（33）：108-102.

[8] 陈奇.防止高淀粉质饮料沉淀的方法[J].食品与机械， 2000，76 （2）： 29-30.

[9] 陈朋引. 马铃薯固体饮料开发及工艺研究[J].食品科技， 2002（10）： 47-49.

[10] 齐香君，苟金霞. 3，5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究[J]. 纤维素科学与技术，2004，12（3）：17-19.

[11] 王成恩， 黄章俊. 基于高斯函数和信赖域更新策略的Kriging响应面法[J]. 计算机集成制造系统， 2011， 17（4）： 740-746.

[12] 李杨， 江连洲， 隋晓楠， 等. 复合酶水酶法提取大豆蛋白的工艺优化[J].食品科学， 2011， 32（14）：130-133.