低次烟叶蛋白质—多酚复合物的成分及抗氧化性分析

许春平++冉盼盼++曾颖++谭兰兰++申屠洪钎++马扩彦++戴亚

摘要：采用碱溶酸沉法从烤烟低次烟叶中提取蛋白质-多酚复合物，检测其中蛋白质含量为350 mg/g，多酚成分包括绿原酸、莨菪葶、芸香苷，其含量分别为2.1、0.5、2.9 mg/g。对蛋白质-多酚复合物进行抗氧化性检测。结果表明，在一定范围内，DPPH·自由基与OH·自由基的清除率随复合物浓度的增加而升高；对蛋白质-多酚复合物中蛋白质进行酶解，酶解产物的抗氧化性测试结果表明，随着酶解时间的延长，复合物对DPPH·自由基与OH·自由基的清除活性均呈下降趋势，说明蛋白质与多酚结合状态下才能保持蛋白质-多酚复合物的抗氧化性，而且其抗氧化性可能主要来源于复合物中的多酚。

关键词：低次烟叶；蛋白质-多酚复合物；酶解；抗氧化性

中图分类号：S572 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0531-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.035

Analysis of Composition and Antioxidant Activity of Protein-polyphenol Complex from Discarded Tobacco Leaves

XU Chun-ping1，RAN Pan-pan1，ZENG Ying1，TAN Lan-lan2，SHENTU Hong-qian2，MA Kuo-yan3，DAI Ya3

（1.College of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2.Technical Center of China Tobacco Chuanyu Industrial Co. Ltd.， Chengdu 610066，China；

3.Technical Center of China Tobacco Chongqing Industrial Co. Ltd.， Chongqing 400060，China）

Abstract： The protein-polyphenol complex was extracted from discarded tobacco leaves by alkali-solution and acid-isolation method. The protein content was detected as 350 mg/g and polyphenol components including chlorogenic acid， scopoletin and rutin， and their contents were 2.1 mg/g， 0.5 mg/g， and 2.9 mg/g， respectively. The antioxidant tests of protein-polyphenol complex showed that in a certain range， the scavenging rate of DPPH· radical and OH· radical increased with the increase of the concentration. The scavenging activity of DPPH· radical and OH· radical was decreased with the time of enzymatic hydrolysis. The results indicated that the antioxidant activity of protein-polyphenol can maintain with the binding stage of protein and polyphenol， and the main source of antioxidant activity could be from polyphenols.

Key words： discarded tobacco； protein polyphenol complex； enzymatic hydrolysis； antioxidant activity

中國是烟草种植大国，也是卷烟生产大国，同时每年产生的低次烟叶也数量庞大，有效利用这些废料既可以保护环境，减轻环境负担，也能创造更高的经济价值。烟叶蛋白质是一种优质的蛋白质资源，作为食用蛋白质来说它比鸡蛋、乳酪和牛奶更适合人体吸收利用，具有较高的营养价值和药用价值[1]。Kung等[2]、Lowe[3]对烟叶FI蛋白质进行了提纯。赵谋明等[4]使用碱溶酸沉法工艺对烟叶蛋白质进行提取。研究表明，提取出的蛋白质是一种蛋白质多酚复合物[5]，其中多酚成分对其生物活性有较大影响。林晓婕等[5]从烟叶中提取出色素蛋白质复合物，表明其中多酚物质对其抗紫外活性起主要作用。王洁[6]研究表明，蛋白质与多酚以非共价形式结合。本试验对提取的蛋白质-多酚复合物的组成进行分析，检测其抗氧化活性，并分析其组成对抗氧化活性的影响，以期为烟叶蛋白质的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

低次烤烟叶粉末（2013年河南襄县产豫烟10号X3L等级烟叶）。浓盐酸、Tris、无水乙醇、磷酸、DPPH、邻二氮菲、PBS磷酸盐、硫酸亚铁、H2O2（30%）以上试剂均为分析纯；甲醇、乙酸为色谱级；绿原酸、芸香苷、莨菪葶为标准品（Sigma公司）；中性蛋白酶（200 000 U/g）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）（江苏锐阳生物科技有限公司）；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白（西安国安生物科技有限公司）；回流装置、水浴锅、低速离心机（湘仪TDZ5-WS型）、紫外分光光度计（UV1700PC型）、Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、色谱柱为Waters Symme-try C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白质-多酚复合物的提取 按照碱溶酸沉法提取低次烟叶蛋白质-多酚复合物[4，7]，低次烟叶打粉过筛，按料液比1∶30（m∶V，下同）加入去离子水，将pH调至8，在50 ℃溶解30 min，以3 000 r/min离心15 min，取上清液调pH至3，酸沉1 h，再3 000 r/min离心15 min得到沉淀，冷冻干燥即为蛋白质-多酚复合物。

1.2.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[8]。标准曲线的绘制：准确配制100 μg/L的标准牛血清蛋白溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用去离子水补至1 mL，然后加入考马斯亮蓝G-250 5 mL，摇匀，放置5 min，在585 nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品检测：准确称取冷冻干燥后的蛋白质-多酚复合物0.1 g，将样品稀释1 000倍，取1 mL用考马斯亮蓝法测定其吸光度，方法同上，通过标准曲线及稀释倍数计算蛋白质含量。计算公式为蛋白质含量（mg/g）=（蛋白质浓度×稀释倍数/1000）/0.1。

1.2.3 蛋白质-多酚复合物中多酚含量的测定 用HPLC对低次烟叶蛋白质-多酚复合物中多酚含量进行测定。准确称取1.00 g蛋白质复合物，加入150 mL 80%甲醇，回流40 min，取1 mL，通过0.22 μm滤膜过滤，进样[5]。

定性试验：标准溶液为80%甲醇配制的0.1 mg/mL绿原酸、0.005 mg/mL莨菪葶、0.1 mg/mL芸香苷。设置3个试验，标准样品为1号，样品组为2号，样品组加入0.1 mL标准样品为3号，进行试验。

外标标准曲线的绘制：将配制好的绿原酸分别取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL，相同条件下进样；将上述莨菪葶、芸香苷也分别取1.2、1.0、0.8、0.6、0.4 mL定容到10 mL进行测定。多酚含量计算方法：多酚含量（mg/g）=多酚浓度×150。

色谱条件：流动相A为水∶甲醇∶乙酸=88∶10∶2（体积比），流动相B为水∶甲醇∶乙酸=10∶88∶2（体积比）。柱温30 ℃，柱流量1 mL/min，进样体积20 μL。梯度0 min，流动相A 为100%；16.5 min，A为80%，B为20%；30 min，A为20%，B为80%。检测器为DAD，检测波长340 nm，参比波长480 nm，分析时间40 min[9]。

1.2.4 烟叶蛋白质-多酚复合物抗氧化能力的测定 采用DPPH法测定低次烟叶蛋白质-多酚复合物对DPPH·自由基的清除能力[10]。采用邻二氮菲法测定低次烟叶蛋白质-多酚复合物对OH·自由基的清除能力[11]。

1.2.5 酶解蛋白质-多酚复合物的抗氧化性测定 用中性蛋白酶和碱性蛋白酶1∶1的混合酶，在60 ℃、pH=7、加酶量0.001 g的条件下，对样品进行酶解，每20 min取一次样，对酶解液进行抗氧化性检测，方法同上。

1.3 数据处理

采用SPSS Statistics17.0统计软件进行统计学分析，均数比较采用Student-t检验，显著性水平P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蛋白质-多酚复合物中蛋白质含量

以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。由标准曲线得到线性方程y=0.009 8x+0.044 2，R2=0.992 8。测得稀释后的样品吸光度为0.387，由方程及稀释倍数得到蛋白质-多酚复合物中蛋白质含量为350 mg/g。

2.2 蛋白质-多酚复合物中多酚的检测

采用HPLC检测蛋白质-多酚复合物中多酚，结果如图2所示。样品中3种成分与标样中物质保留时间相似，通过标准加入法进一步说明该物质与标样中物质相同，根据保留时间依次为绿原酸、莨菪葶、芸香苷，其比例与烤烟烟叶中游离态多酚比例相似[10]。

以不同浓度的标样进行外标标准曲线测定，外标标准曲线方程分别为绿原酸y=3×10-5x（R2=0.992 1）、莨菪葶y=1×10-5x（R2=0.995）、芸香苷y= 4×10-5x（R2=0.991 3），通过方程得到绿原酸浓度为0.014 0 mg/mL，莨菪葶浓度为0.003 3 mg/mL，芸香苷浓度为0.019 0 mg/mL，从而计算出蛋白质-多酚复合物中多酚含量分别为2.1、0.5、2.9 mg/g。

2.3 蛋白质-多酚复合物的抗氧化能力

2.3.1 蛋白质-多酚复合物对DPPH·自由基的清除能力 对于不同蛋白质-多酚复合物浓度及不同水解程度进行DPPH·自由基清除试验，样品稀释为蛋白质浓度3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、70.0、116.7、175.0 μg/mL。从图3可以看出，蛋白质-多酚复合物在较低浓度时就可清除DPPH·自由基，在3.5～35.0 μg/mL，蛋白质-多酚复合物对DPPH·自由基的清除效率与蛋白质-多酚复合物浓度呈剂量-效应关系，也就是随着低次烟叶蛋白质-多酚复合物浓度的增加，对DPPH·自由基的清除率增大（P<0.05），当浓度为35.0 μg/mL时，蛋白质-多酚复合物对DPPH·自由基的清除率达到89.7%，之后隨着蛋白质-多酚复合物浓度的增加，对DPPH·自由基的清除率增加不显著（P>0.05）。

用蛋白酶对蛋白质-多酚复合物进行酶解，其对DPPH·自由基的清除效果如图4所示。随着酶解时间的延长，蛋白质-多酚复合物中蛋白质的水解程度越高，对DPPH·自由基的清除活性呈下降趋势（P<0.05）。蛋白酶的水解作用仅仅是针对蛋白质中的肽键，而对其功能基团不会破坏，水解后蛋白质-多酚复合物活性的降低表明其抗氧化活性来源并不是蛋白质。结合对蛋白质-多酚复合物中多酚的检测，可以推断蛋白质-多酚复合物的强抗氧化活性可能来源于多酚的作用[12]，而其结合形式为非共价结合[13]。蛋白质的水解使其与多酚的结合被破坏，失去蛋白质的结合后多酚的抗氧化活性不宜保持，从而导致了复合物抗氧化活性的下降。

2.3.2 蛋白质-多酚复合物对OH·自由基的清除能力 对不同蛋白质-多酚复合物浓度及不同水解程度进行OH·自由基清除试验，将样品稀释为蛋白浓度分别为3.5、4.4、5.8、8.8、17.5、35.0、43.8、58.5、87.5、175.0、350.0、700.0 μg/mL，样品蛋白质-多酚复合物中蛋白浓度与清除羟基自由基的能力如图5所示。与蛋白质-多酚复合物清除DPPH·自由基的清除效果相似，在较低浓度时，蛋白质-多酚复合物就可清除羟基自由基，在4.4～175.0 μg/mL时，随着蛋白质-多酚复合物浓度的升高，对羟基自由基的清除率也升高（P<0.05），当蛋白质-多酚复合物中蛋白质浓度为175.0 μg/mL时，对羟基自由基的清除率为79.55%，之后随着蛋白质-多酚复合物浓度的增加，对羟基自由基的清除率增加不显著（P>0.05）。

采用蛋白酶酶解蛋白质-多酚复合物，随着酶解时间的延长，蛋白质-多酚复合物中蛋白质水解程度增大，对OH·自由基的清除率呈下降趋势（P<0.05）（图6）。这与之前对DPPH·自由基的清除结果相似，也进一步证明蛋白复合物中含有多酚，可能与其非共价结合，这种结合态使得多酚更加稳定，使蛋白质-多酚复合物具有抗氧化性，在蛋白质被水解后，这种复合物被破坏，从而导致蛋白质-多酚复合物抗氧化性降低。

3 小结

碱溶酸沉法提取低次烟叶中蛋白质-多酚复合物，对其进行成分分析，其蛋白质含量为350 mg/g，多酚中绿原酸2.1 mg/g，莨菪葶0.5 mg/g，芸香苷2.9 mg/g。对其进行抗氧化性检测，结果表明，其抗氧化活性随着蛋白质-多酚复合物浓度增大而增大，蛋白质酶解后随着酶解时间的增加抗氧化活性降低，表明蛋白质-多酚复合物中抗氧化活性可能主要来源于与其非共价结合的多酚，且在结合的状态下才能保持蛋白复合物的抗氧化活性。

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