超声辅助酶解制备猪血血红素及紫外—可见吸收光谱分析

刘文营++张振琪++成晓瑜++李迎楠++贾晓云++李家鹏++陈文华++曲超

摘 要：运用超声辅助酶解进行猪血血红素的制备，并对猪血血红素在不同环境下紫外-可见吸收光谱进行分析。结果表明：超声可以使酶活力提高25.5%，提高了酶解反应效率，缩短了酶解反应所需时间；对酶解产物pH值调节后进行离心分离血红素，并经纯水洗涤后再次离心，对血红素样品进行真空冷冻干燥；通过与血红素标准品比对，所得产品纯度达到83.2%。在碱性条件下，血红素溶液具有明显的特征吸收光谱；在酸性条件下，血红素溶液在300～400 nm和640 nm附近的特征吸收光谱发生了显著变化，吸收值明显降低。

关键词：酶解；猪血；血红素；吸收光谱

Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Porcine Heme and Characterization by UV-Vis Absorption Spectroscopy

LIU Wenying1， ZHANG Zhenqi2， CHENG Xiaoyu1，*， LI Yingnan1， JIA Xiaoyun1， LI Jiapeng1， CHEN Wenhua1， QU Chao1

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China； 2.Beijing Light Industry Polytechnic College， Beijing 100070， China）

Abstract： Porcine heme was prepared by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of porcine red blood cells with Protamex and its UV-Vis absorption characteristics under acidic and alkaline conditions were analyzed. Results revealed that ultrasonic treatment resulted in a 25.5% increase in the enzyme activity， augmenting the hydrolysis efficiency and shortening the hydrolysis time. After pH adjustment of the hydrolysate， centrifugal separation of heme was carried out， followed by washing with purified water， second centrifugation and vacuum freeze drying. The product purity was determined using heme standard to be 83.2%. Under alkaline condition， the heme exhibited the obvious characteristic absorption， whereas under acidic condition， its characteristic absorption in the region of 300–400 nm and near 640 nm changed noticeably， showing a pronounced decrease in absorbance values.

Key words： enzymatic hydrolysis； pig blood； heme； absorption spectrum

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001

中图分类号：TS251.93 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）03-0001-04

引文格式：

刘文营， 张振琪， 成晓瑜， 等. 超声辅助酶解制备猪血血红素及紫外-可见吸收光谱分析[J]. 肉类研究， 2016， 30（3）：

1-4. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LIU Wenying， ZHANG Zhenqi， CHENG Xiaoyu， et al. Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of porcine heme and characterization by UV-Vis absorption spectroscopy[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 1-4. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

血是畜禽屠宰加工过程产生的主要副产物之一，我国2014年全年猪肉总产量为5 671万 t，在满足人们消费需求的同时，产生了大量猪副产物，其中猪血占有重要部分[1]。血液中含有大量的蛋白质、维生素、矿物质和其他物质，被誉为“液体肉”，其中尤其以血细胞中蛋白质和铁含量最为丰富[1-2]。

目前人们对猪血的应用集中在食品、饲料、化工和医学等领域，食品上主要是进行血豆腐、血肠等的加工，或者利用血红素增加肉制品的着色效果；在饲料应用上主要是补充蛋白质和矿物质等，增加非反刍动物的免疫力；而医学上主要是生物制剂的开发。但是鉴于其在食品加工上附加值较低，饲料利用上又考虑到物种的同源性，使其利用受到限制；而在医学上进行生物制剂的加工，包括血红蛋白肽、血红素等的加工，基于其来源广、成本低廉和易于加工，将会产生良好的经济效益和社会效益，应用前景广阔[3-4]。

缺铁是当今世界上最为严重的营养缺乏症之一，缺铁会对生物体产生各种损害[5]。传统的补铁制剂主要是二价的非血红素铁，如硫酸亚铁和有机酸亚铁盐类等，这些补铁制剂易受其他因素干扰，吸收效率不高，同时，体内金属铁离子过多时，会诱发体内产生大量自由基，对身体健康产生危害。因此寻找一种安全、高效的补铁制剂迫在眉睫。血红素是一类铁卟啉化合物，结构如图1所示[6]，是红细胞的主要成分之一，血红素在小肠内直接被上皮细胞吸收，不受植酸盐等物质影响，吸收率可达15%～20%[7-8]，为其作为一种安全有效的铁制剂提供了方便。

血红素的传统制备方法，主要有冰醋酸法、酸性丙酮法、羧甲基纤维素法和蛋白酶水解法等。鉴于有机溶剂难以回收、产品纯度较低、生产成本高和生产周期长等缺点，目前普遍采用酶解法[9-10]。本研究旨在通过超声辅助酶解反应制备血红素，对其提取效果进行分析，并针对血红素在不同环境下的稳定性进行分析，以期对血红素更好地提取、利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血采自北京资源亚太食品有限公司，采血后加入5‰柠檬酸三钠抗凝，充分混匀后冷藏备用。

二水合柠檬酸三钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸、盐酸、硫酸、氯化钠均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司；ProtamexTM复合蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

CR21GⅢ离心机 日本日立株式会社；LCH-18恒温水槽 日本三洋株式会社；BSA822-CW天平、PB-10

pH计 德国赛多利斯集团；F6/10-10G超细匀浆器

上海Fluko流体机械制造有限公司；Agilent 7700电感耦合等离子体质谱仪 美国安捷伦科技公司；Cary 50 spectrophotometer紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；Cascada BIO纯水机 美国Pall公司；UP-400S手

提式超声波细胞破碎仪 宁波新芝公司；TANK微波消解仪 济南海能仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血红蛋白溶液的制备

将加入抗凝剂的血液，在3 000 r/min条件下离心10 min，将获得的沉淀加入0.9%的NaCl溶液搅匀后再次离心，重复3 次；将获得的沉淀在沸水下加热10 min，用均质机充分均质，置于4 ℃备用。

1.3.2 超声条件的选择

参考文献[11]方法测定酶活性大小。超声条件选择的依据是酶活力的大小，依据酶最适活性温度，将酶反应的条件设为40 ℃、pH 6.0。通过改变超声的功率大小，对比酶活性的大小，选择最为合适的超声条件。

1.3.3 水解度测定[12-13]

（1）

式中：AN为氨基态氮含量/（mol/L）；TN为总氮含

量/（mol/L）。

1.3.4 水解条件工艺参数的选择

将制备好的血红蛋白水溶液pH值调节至6.0，设定反应温度为40 ℃，待恒温后加入反应酶，开始反应。水解过程中，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液，保持反应体系pH值的恒定，水解反应结束后，将酶反应液在沸水浴中加热10 min灭酶。

参考文献[12-14]方法，测定水解度和上清液在383 nm波长处吸光度A383 nm，确定所需的反应时间。

1.3.5 血红素的分离纯化

将水解液在30 ℃保温后，将水解液调节为pH 4.0，分别在3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 r/min离心，通过在383 nm波长处测定吸光度A383 nm，确定最佳沉淀的转速；将水解液调节为pH 4.0，在4 000 r/min下离心，通过在383 nm波长处测定吸光度A383 nm，确定最佳离心时间。

1.3.6 铁离子含量的测定

参考文献[15-16]方法，采用微波消解和电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法测定样品中铁离子含量，并略有修改。

微波消解条件为：样品加入10 mL消解液（HNO3∶HCl=5∶2，V/V），分别在120 、180、150 ℃条件下1 500 W超声2 min，然后定容待用。

ICP-MS操作参数如下：功率1 270 W，冷却气流量（Ar）12 L/min，雾化气流量（Ar） 1 L/min，扫描次数200 次，停留时间10 ms，总采样时间18 s。

1.3.7 血红素的提取率和纯度的测定

（2）

式中：产品中血红素含量、原料中血红素含量（以铁含量换算为血红素含量/g）。

（3）

式中：产品中铁含量（以ICP-MS测定铁含量计/%）；纯品血红素铁含量（以血红素理论值计13.77%）。

1.3.8 吸收光谱学分析

参考文献[17-18]方法，并略有修改，样品制备后扫描190～1 100 nm紫外-可见吸收光谱，扫描波长为1 nm，扫描3 次，取平均值。

1.4 数据分析

实验均进行3 次重复，取平均值，使用Excel、Origin 8.0

进行数据整理和制图。

2 结果与分析

2.1 血红素制备条件的选择

2.1.1 超声对酶活力的影响

实验中选用的酶为复合蛋白酶，最适的反应条件为40 ℃、pH 6.0。由图1可知，随着超声频率的增加，酶活力的大小呈现先增加后减小的趋势，在21 kHz时酶活力最高，较之不超声酶活力增加25.5%。先前亦有研究[19]报道超声能够增强酶的活性，在一定程度上缩短酶解反应所需的时间。

2.1.2 酶解时间的选择

酶解反应能够将血红素与结合的珠蛋白等分离，酶解过程中的水解度和上清液吸光度如图3所示。随着反应的进行，水解度逐渐增加，同时上清液的吸光度也呈现先增加后稳定的趋势。水解度的增加是由于复合蛋白酶对红细胞蛋白的水解作用，将血红蛋白等分解为血红素、血红蛋白肽等，血红素的释放使得上清液的特征吸光度A383 nm增加。结合水解度和特征吸光度A383 nm，考虑到投入的成本和生产效率，在2.5 h时基本达到需要，认定为需要的反应时间。同时，考虑到酶解反应的酶种类的不同和反应处理条件的不同，酶解时间各不相同[9-10，12]。

2.1.3 血红素提取条件的选择

由图4a可知，在固定离心时间15 min条件下，随着离心转速的增加，上清液A383 nm呈现逐渐下降的趋势，在离心转速达到4 000 r/min以后，离心转速的增加对上清液吸光度的大小影响不大，考虑到提取时间和成本消耗，选择对血红素在4 000 r/min下分离；而同样，在离心处理的时间上，如图4b所示，随着离心时间的增加，上清液A383 nm也是呈现下降的趋势，从35 min时开始，随着离心时间的延长，上清液吸光度变化较为缓和，所以，亦选择处理35 min。血红素样品的分离条件选为4 000 r/min、35 min。依照以上方法制备的血红素的纯度为83.2%，提取率为30.2%，较文献方法有所提高[9-10，14]。

2.2 血红素的紫外-可见吸收光谱

2.2.1 碱性条件下血红素紫外-可见吸收光谱

文献报道显示，血红素在383、403、575、640 nm波长附近有特征吸收[3，14，20-21]。由图5可知，所得样品在383、403、640 nm波长处有明显的吸收峰，而575 nm波长处亦处于特征吸收光谱范围内，结果与文献报道一致。

2.2.2 血红素在酸性条件下的紫外-可见吸收光谱

由图6可知，血红素在碱性溶液中，其溶液在383、403、575、640 nm具有明显的特征吸收光谱，但是在酸性条件下，其300～400 nm和640 nm附近的特征光谱吸收发生了明显的下降，说明酸性条件对血红素的结构产生了影响；同时，在400 nm附近的最大吸光度在酸性条件下也产生了明显的降低，说明酸性条件对血红素及其衍生物的溶解性有显著影响，与文献报道结果一致[14，21]。

3 结 论

运用复合蛋白酶进行猪血血红素制备的条件为：3 000 r/min下离心10 min分离血红蛋白，并进行3 次洗涤；血细胞沸水条件下加热10 min使蛋白变性，然后匀浆均质；复合蛋白酶反应条件为40 ℃、pH 6.0，反应2.5 h；4 000 r/min条件下离心35 min，纯水洗涤3 次后收集沉淀，并对样品冷冻干燥；制备的血红素的纯度是83.2%，提取率为30.2%。

血红素在碱性条件下，在383、403、575、640 nm波长处具有明显的特征吸收光谱；血红素在酸性条件下，特征光谱吸收值下降明显，尤其是在300～400 nm和640 nm附近，说明酸性条件对血红素的稳定性有直接影响。

实验通过血红素溶液在不同条件下的特征吸收光谱的变化，对揭示血红素的稳定性有重要意义，为血红素作为色素应用于不同肉制品中提供参考，为血红素的妥善保存、有效利用和消除提供思路。针对血红素在不同条件下的变化机理尚需更进一步研究。

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