酶解牦牛骨粉骨髓粉对大鼠骨密度影响的研究

肖帆+徐蔷+李华迪

摘要：目的 研究酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸鈣的补钙效果。方法 实验采用60只体重（65±5）g的SPF级4周龄雌性SD大鼠，分为6组每组10只，即原始饲料组、酶解骨粉骨髓粉组（低、中、高三组）、牦牛骨粉骨髓粉组、碳酸钙组，投喂含有相应补钙产品的饲料，喂养14 w。每周测一次体重，喂养3 w后进行钙代谢实验，喂养14 w后处死取出左侧股骨，测量骨长、干重、骨钙以及骨密度等指标。结果 酶解骨粉骨髓粉、牦牛骨粉骨髓粉、碳酸钙以及原始饲料组的大鼠喂养14 w后的体重、股骨长度无明显差异（P>0.05）；酶解骨粉骨髓粉、牦牛骨粉骨髓粉、碳酸钙组的钙表现吸收率低于原始饲料组钙表现吸收率（P<0.05），但是酶解骨粉骨髓粉组钙表现吸收率高于同剂量组的牦牛骨粉骨髓粉组及碳酸钙组（P<0.05）；三种钙剂组的大鼠骨密度均高于原始饲料组（P<0.01），酶解骨粉骨髓粉组的大鼠骨密度高于碳酸钙组以及牦牛骨原粉组的大鼠骨密度（P<0.05）；10倍、30倍酶解骨粉骨髓粉组的骨干重高于原始饲料组以及同剂量的其他钙剂组（P<0.01），其余各组钙剂的骨干重均无明显差异；10倍、30倍的钙剂组的大鼠骨钙含量高于原始饲料组大鼠骨钙含量（P<0.05）且酶解骨粉骨髓粉组（P<0.01），同剂量的酶解骨粉骨髓粉组的大鼠骨钙含量高于同剂量的其他两组的骨钙含量（P<0.01）。结论 与牦牛骨原粉以及碳酸钙相比，酶解骨粉骨髓粉不仅能提高钙表现吸收率，而且还能显著增加骨密度以及骨钙含量，是一种优秀的钙补充剂。

关键词：牦牛骨粉；牦牛骨髓粉；多肽螯合钙；骨密度；钙表现吸收率；酶解

Abstract：Objective To study the enzymatic hydrolysis of yak bone marrow powder mixture，mixture of yak bone marrow powder，calcium carbonate， calcium effect.Methods Using 60 weight（65±5） g SPF level 4-week-old female SD rats，divided into 6 sets of 10，the original group，enzymatic bone bone marrow Group（a group of low，medium，and high），yak bone bone marrow，calcium carbonate groups，fed with feed containing calcium products， feeding 14 w.Measured weight per week，feeding calcium metabolism experiments after 3 w，feeding 14 w after death removed the left femur，measure bone length，dry weight，calcium，and bone density，and so on. Results Enzymatic hydrolysis，yak bone marrow bone marrow powder powder，calcium carbonate，as well as the original feed rats after feeding 14 w weight，no significant difference in the length of the femur （P>0.05），enzymatic hydrolysis， yak bone marrow bone marrow powder powder，Calcium carbonate group of calcium performance absorption rate below original feed group calcium performance absorption rate（P<0.05），but enzyme solutions bone meal bone marrow powder group calcium performance absorption rate above with dose group of yak bone meal bone marrow powder group and the calcium carbonate Group（P<0.05）； three species calcium Agent Group of big rat bone density are above original feed group（P<0.01），enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of big rat bone density above calcium carbonate group and yak bone original powder group of big rat bone density（P<0.05）；10 times times，and 30 times times enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of backbone heavy above original feed group and with dose of other calcium Agent Group（P<0.01）， remaining the Group calcium agent of backbone heavy are no obviously differences；10 times，and 30 times of calcium Agent Group of big rat bone calcium content above original feed group big rat bone calcium content （P<0.05） and enzyme solutions bone meal bone marrow powder group （P<0.01），with dose of enzyme solutions bone meal bone marrow powder group of big rat bone calcium content above with dose of other two group of bone calcium content （P<0.01）.Conclusion Comparing with yak bone powder，calcium carbonate，enzymatic bone bone marrow can enhance calcium absorption，but also significantly increased bone mineral density and bone calcium content， calcium is an excellent supplement.

Key words：Yak bone powder；Yak bone powder；Polypeptide chelated calcium；Bone mineral density；Calcium absorption performance；Enzymatic hydrolysis

根据2015年“中国民营养与慢性病状况报告”调查结果显示，我国人民膳食营养摄入量中钙的摄入量依旧不足，钙缺乏尤为明显[1-2]。因此寻找来源丰富、质优价廉、吸收率高的补钙产品，对于预防缺钙和骨质疏松具有十分重要的意义。骨骼中的钙主要以难溶的羟基磷酸钙存在，采用简单的物理方法制得的补钙产品不利于人体吸收利用。而通过生物酶工程促使骨骼中的钙转化为游离钙离子，并与多肽螯合生成多肽螯合钙，能较好的促进机体对钙的利用。因此，开发利于人体吸收的新型补钙制剂，对于改善中国人群钙缺乏具有重要的意义。本实验以SPF级4 w龄雌性SD大鼠为模型，通过比较酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸钙对大鼠体重、骨钙、骨密度及钙表现吸收率的影响。为此类产品在人体内吸收利用的效果研究提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1钙剂 酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、牦牛骨粉骨髓粉混合物、碳酸钙，其中牦牛骨粉、牦牛骨髓粉由青海雪牛生物提供，酶解牦牛骨粉骨髓粉利用牦牛骨原粉、骨髓粉使用酶解工艺由实验室通过双酶酶解后制得，碳酸钙由上海诺成药业提供，中性蛋白酶（40万U/g）、木瓜蛋白酶（80万U/g）由广西南宁庞博生物工程有限公司提供，并检测每100 g样品中钙的含量[3]，含钙量分别为酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物中含钙量为27.7%，牦牛骨原粉含钙量为25.0%，碳酸钙含钙量为40.0%。

1.1.2试验动物 实验采用60只体重（65±5）g的SPF级4周龄雌性SD大鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供。饲养环境为屏障环境，实验环境温度23～24℃，湿度55%～58%。

1.1.3动物饲料 动物基础饲料配方为酪蛋白10.0%、黄豆粉15.0%、小麦面粉53%、花生油4.0%、2.3%纤维素、3.3%混合矿物质、1.0%混合维生素、0.2%氯化胆碱、0.2%DL-蛋氨酸、11.0%淀粉。调整钙含量为100 mg/100 g饲料。用此饲料配方配置钙剂组，可根据钙剂的需要量调节淀粉用量。上述动物饲料由中国医学科学院实验动物研究所提供。饲料在加工、运输、储存过程中应严防污染、发霉、变质，饲料在称量过程中应严防人为的饲料洒落。

1.1.4主要仪器设备 双能X线吸收骨密度仪（DEXA，Hologic Delphi A），原子吸收分光光度计（HG 9620A 型）。

1.2试验方法

1.2.1酶解骨粉骨髓粉的制备[4-6] ①牦牛骨粉和牦牛骨髓粉以4∶1的比例混合，添加混合物总质量的8倍纯水，混合搅拌均匀，加热至40℃，调节pH值至7.0加入中性蛋白酶反应30 min；②调节pH至5.0，调节温度为60℃，加入木瓜蛋白酶反应1 h；③调节pH至7.0，调节温度为65℃，继续反应2 h后收集混合物，干燥后保存备用。

1.2.2动物分组以及钙剂剂量设置 大鼠经过适应性喂养1 w后，按体重随机分为6组，每组10只，分为原始饲料对照组A，酶解牦牛骨粉骨髓粉组B1、B2、B3，牦牛骨粉骨髓粉组C，以及碳酸钙组D。其中除了原始饲料对照组外，其余各组都是在原始饲料组的基础上以掺入的方式将钙剂添加到原始饲料中。人体推荐钙摄入量为1000 mg/d[7-9]，按照体重60 kg计算，得16.7 mg/kg，设置5、10、30倍人体推荐量的低、中、高钙剂组对应B1、B2、B3，C组为人体推荐量的10倍，D组也为人体推荐量的10倍。A组调节钙含量为100 mg/100 g，其余5组理论钙含量为B1 183.5 mg/100 g，B2 267 mg/100 g、B3 601 mg/100 g，C 267 mg/100 g，D 267 mg/100 g，实际测得5组钙含量为B1 156 mg/100 g，B2 238 mg/100 g，B3 585 mg/100 g，C 241 mg/100 g，D 235 mg/100 g。

1.2.3饲养方法 按大鼠摄食量10%计，分别将钙剂掺入饲料中，大鼠均单笼饲养，自由摄食，饮用去离子水，以避免从水中获得钙，饲养14 w。

1.2.4观察指标 ①体重：实验期间每周称体重1次。②代谢实验：实验3 w后将动物放在代谢笼中进行3 d钙代谢实验。记录3 d进食量，收集72 h粪便，测定粪便、饲料中钙含量，利用原子吸收法测定。继续饲养至14 w。钙表现吸收率=（摄入钙-粪钙）/摄入钙×100%。③骨密度测定：以双能X线吸收骨密度仪（DEXA）测定股骨中点、远心端（BMD）。将待测骨放置于测量台上与骨密度仪测头移动方向垂直；移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量，每点测定5次，5次结果中若有两组结果不平行（误差<10%），则重新测定。取平均值，以骨宽（BW）除骨矿物质含量（BMC），其结果即为骨密度（BMD）。④股骨长度，干重：剥离两侧股骨，剔除肌肉和筋膜，取左侧股骨105℃烘箱烘干至恒重，游标卡尺量骨长，称重。⑤骨钙测定：取烘干至恒重的左側股骨、经混和酸（硝酸∶高氯酸=4∶1）湿消化后，以0.5%的氧化镧溶液定容，采用原子吸收分光光度计（HG9620A型）测定其含钙量。

1.3统计学分析 采用SPSS软件进行单因素方差分析和LSD检验。

2 结果

2.1对大鼠体重的影响 见表1。实验初始期间各组大鼠体重无明显差异。实验期间，各组大鼠的体重都有不同程度的增长。实验结束时，钙剂组大鼠体重明显高于原始饲料组大鼠体重，但钙剂组各组之间无明显差异。

2.2对大鼠钙表现吸收率的影响 见表2。实验各组钙的表现吸收率均明显低于原始饲料组（P<0.05），这与机体缺乏钙时吸收率增加有关。酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物的钙表现吸收率比同剂量的其他钙剂组有显著增加。牦牛骨粉组和同剂量的碳酸钙组无明显差异（P<0.05）。由此可以证明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物具有增加大鼠钙表现吸收率的作用。

2.3對大鼠股骨骨密度的影响 见表3。钙剂组大鼠骨密度与原始饲料组大鼠骨密度有极显著差异（P<0.05），同时同剂量酶解牦牛骨粉骨髓粉组与碳酸钙组、纯牦牛骨粉组有显著差异（P<0.05）。以上结果可以得出，酶解牦牛骨粉骨髓粉组对大鼠骨密度的提高具有很大作用。

2.4对大鼠股骨长度、干重的影响 见表4。不同钙剂对大鼠的骨长度均无显著性差异（P>0.05），A组、B1组、C组、D组的骨干重无显著性差异（P>0.05），B2、B3组即10倍以及30倍酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物组的骨干重高于原始饲料组A，牦牛骨粉骨髓粉组以及碳酸钙组，有极显著差异（P<0.01）。以上结果表明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物具有增加大鼠骨干重的作用。

2.5对大鼠骨钙的影响 见表5。钙剂组均比原始饲料组A有显著差异（P<0.05），且酶解牦牛骨粉骨髓粉组有极显著差异（P<0.01）。酶解牦牛骨粉骨髓粉组与同剂量牦牛骨原粉组有极显著差异（P<0.01），与同剂量碳酸钙组同样有极显著差异（P<0.01）。碳酸钙组与同剂量牦牛骨原粉组无显著差异。由此可以表明，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物对大鼠股骨骨钙含量的增加有极大的作用。

3 讨论

牦牛骨粉含有丰富的营养素，除含钙20%～30%、磷8%～14%外，还含有丰富的微量元素，蛋白质含量35.7%，占总量26.694%的18种氨基酸中，必须氨基酸占总量的5.518%，骨粉中钙的存在形式有利于动物吸收，因为骨粉中的钙主要以羟基磷灰石结晶形式存在，该结晶与胶原纤维结合在一起，骨粉中胶原纤维酶解后，羟基磷灰石结晶就部分解离，进而转化为水溶性氨基酸钙，这种物质极易被动物吸收[10-11]。牦牛骨髓含有丰富的蛋白质、Ca、P、Fe、Zn、Cu，以及软骨素、卵磷脂、多种维生素等营养成分，营养价值极高。牦牛骨髓中还含有多种氨基酸，包括人体内不能合成的必需氨基酸，具有补充机体营养成份和提高免疫力的作用，特别是其中含有人脑中不可缺少的磷脂质、磷蛋白与防止人体老化的骨胶朊和软骨素，而且钙磷比例合理，易于人体的消化吸收[12-13]。通过酶解骨粉以及骨髓粉混合物，使钙与多肽作用螯合生成多肽螯合钙，促进钙的利用[14-15]。本实验选取了酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物、纯牦牛骨粉，以同剂量碳酸钙为对照，观察其对大鼠的补钙影响。为酶解牦牛骨粉骨髓粉在人体内的吸收利用的效果研究提供一定的实验依据。

从本实验结果可以看出，酶解牦牛骨粉骨髓粉混合物与碳酸钙、纯骨粉相比，不仅能提高钙表现吸收率，而且还显著增加骨密度以及骨钙含量。这可能与酶解牦牛骨粉骨髓粉后产生的多肽钙、适当的钙磷比等有关。综上所述，本实验可以初步判定酶解牦牛骨粉骨髓粉可以作为一种效果上佳的钙源，是作为钙补充剂的较好选择。

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编辑/杨倩