林蛙油对游泳训练小鼠腓肠肌保护作用研究

张平，张岚，鲍九枝，李松哲

（1.吉林医药学院军事体育教学部，吉林吉林 132013；2.吉林医药学院营养与食品卫生教研室，吉林吉林 132013）

在正常生理条件下，机体会产生少量的自由基，机体自身的抗氧化系统可以及时清除自由基。运动应激可导致机体自由基产生增加，抗氧化能力降低。运动源性自由基生成的增加是导致疲劳的重要因素之一。为预防和延缓由于自由基代谢引发的运动性疲劳和氧化损伤，许多学者做了研究，首先，应提高机体本身对自由基的防御能力，通过膳食改变来减少自由基的损害；其次，应重视抗氧化剂的应用，如VE、VC及一些中药复合物。林蛙油是一种营养保健价值极高的药食两用食物具有抗疲劳作用[1－3]，关于林蛙油对运动过程中抗自由基氧化功能的影响研究报道较少。本文通过建立小白鼠运动训练及一次力竭性游泳的疲劳模型来揭示林蛙油对腓肠肌组织中SOD活性和MDA含量的影响，借助透射电子显微镜，从腓肠肌细胞超微结构上来研究林蛙油的抗氧化，保护腓肠肌的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 林蛙油

吉林市市售，－20℃冰箱保存备用。按成人日摄入量6 g/60 kg体重的1、5、10倍设计。加水将林蛙油泡发12 h后，盖上保鲜膜放入锅内蒸15 min，冷却，匀浆，制成所需浓度，冰箱内保存备用。

1.1.2 实验动物

ICR雄性小鼠，20 g～22 g，65只，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，适应性饲养一周后进行实验。自由进食和饮水，每日自然光照，室温22℃～25℃。

1.1.3 主要仪器

TD－5A离心机：湖南凯达湖南凯达科学仪器有限公司；JD－XSC小鼠恒温游泳池：上海继德教学实验器械厂；722分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；JEM－1200EX透射电子显微镜：日本；LKB—8800型超薄切片机：瑞典LKB公司；九阳料理机：九阳股份有限公司。

1.1.4 主要试剂

超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测试盒：南京建成生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

将小鼠按体重随机分为5组，为安静组、运动组、林蛙油低剂量组、中剂量组和高剂量组。每组13只小鼠，其中安静组和运动组灌胃蒸馏水，林蛙油各组给予对应的林蛙油匀浆液灌胃，每组灌胃剂量为0.4 mL。每周称重一次，调节林蛙油灌胃剂量。

1.2.2 小鼠运动模型的建立

运动组和林蛙油各剂量组进行4周的游泳训练，水深不低于40 cm，水温（26±2）℃，每周训练 6 d，休息1 d，每次灌胃30 min后进行游泳训练。第一周每天游泳30 min，以后每周运动时间递增15 min。第4周后最后1 d灌胃30 min后，各组进行无负重力竭性游泳，记录游泳时间。游泳至力竭判断标准为：小鼠沉入水中8 s不能自主浮上水面，且放在平面上无法完成翻正反射，记录小鼠自游泳开始至沉入水中8 s不能浮起时间。

1.2.3 腓肠肌组织超氧化物歧化酶活性（SOD）和丙二醛（MDA）含量测定

于第4周最后1 d，力竭运动后，眼球取血，断头处死，取左后肢相同部位腓肠肌组织，4℃预冷，生理盐水洗净，于冰水中用电动匀浆机制成100 g/L的匀浆液，3 000 r/min，离心 10 min，取上清液，4℃冰箱保存备用。超氧化物歧化酶活性（SOD）、丙二醛（MDA）含量测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，测试方法严格按照试剂盒内说明书进行。

1.2.4 透射电镜腓肠肌标本制备

各组随机取小鼠3只，断头处死，取右侧腓肠肌，将其切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm组织块，放在2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%锇酸后固定，梯度丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片机LKB—8800切片，透射电子显微镜JEM－1200EX进行观察照相。

1.3 统计学处理

实验数据以±s表示，用SPSS10.0统计软件进行统计处理，各组间差异采用SNK检验。

2 结果

2.1 不同剂量林蛙油对游泳训练小鼠游泳至力竭时间的影响

林蛙油对游泳训练小鼠游泳至力竭时间的影响，见表1。

表1 林蛙油对游泳训练小鼠游泳至力竭时间的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of Rana oil on trained mice swimming exhausted time（±s，n=10）

表1 林蛙油对游泳训练小鼠游泳至力竭时间的影响（±s，n=10）Table 1 Effect of Rana oil on trained mice swimming exhausted time（±s，n=10）

注：与安静组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与运动组比较 ，#p＜0.05，##p＜0.01。

组别 力竭时间/min对照组 95.90±8.41运动组 111.00±10.36低剂量组 111.40±7.24中剂量组 286.80±59.01##高剂量组 243.50±48.65##

由表1可知，游泳训练能显著延长小鼠力竭性游泳时间。游泳训练的同时补充林蛙油，可使力竭性游泳时间进一步显著延长。林蛙油各剂量组小鼠游泳时间中剂量组最高，各剂量组与训练运动组比较，中、高剂量组有显著差异（p＜0.01）。

2.2 不同剂量林蛙油对运动训练小鼠腓肠肌SOD活性和MDA含量的影响

林蛙油对运动训练小鼠腓肠肌SOD活性和MDA含量的影响见表2。

表2 林蛙油对游泳训练小鼠腓肠肌SOD活性和MDA含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Rana oil on trained mice gastrocnemius muscle SOD activity and MDA content（±s，n=10）

表2 林蛙油对游泳训练小鼠腓肠肌SOD活性和MDA含量的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Rana oil on trained mice gastrocnemius muscle SOD activity and MDA content（±s，n=10）

注：与安静组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与运动组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

组别SOD/（U/mgprot）MDA/（nmol/mgprot）安静组 21.12±1.98 5.24±0.96运动组 11.99±1.72** 6.96±1.23**低剂量组 13.03±1.62 5.48±0.99##中剂量组 14.56±1.06# 5.19±0.76##高剂量组 14.10±1.31# 4.97±0.19##

表2结果表明，运动组SOD活性显著降低，与安静组比较，有显著差异（p＜0.01）；与林蛙油各剂量组比较，中、高剂量组有显著差异（p＜0.05）。运动组MDA的含量最高，与安静组比较，有显著异（p＜0.01）与林蛙油各剂量组比较，均有显著异（p＜0.01）。

2.3 林蛙油对游泳训练小鼠腓肠肌组织超微结构的影响

图1 对照组腓肠肌×6 000Fig.1 Gastrocnemius of control group×6 000

图2 对照组腓肠肌×10 kFig.2 Gastrocnemius of control group×10 k

对照组腓肠肌细胞核仁明显，核膜清晰，核内常染色质多，胞质内肌原纤维排列紧密，明、暗带肌节结构清晰，可见少量线粒体位于肌原纤维之间和较多糖原颗粒（见图1、图2）。运动组腓肠肌细胞核内异染色质增多，核基质略致密，肌原纤维上肌节结构可辨，但呈致密状，线粒体嵴断裂，呈空化状（见图3、图4）。林蛙油运动组腓肠肌细胞核内异染色质略增多，肌原纤维上肌节结构清晰，其间可见少量线粒体位和较多糖原颗粒，但略呈致密状，个别线粒体致密、局部空化。（见图 5、图 6）。

图3 运动组腓肠肌×7 500Fig.3 Gastrocnemius of trained group×7 500

图4 运动组腓肠肌×12 kFig.4 Gastrocnemius of trained group×12 k

图5 林蛙油运动组腓肠肌×7 500Fig.5 Gastrocnemius of Rana oil trained group×7 500

图6 林蛙油运动组腓肠肌×10 kFig.6 Gastrocnemius of Rana oil trained group×10 k

3 讨论

急性运动和力竭运动都可以导致内源性氧自由基生成增多，自由基在肌肉运动性损伤和运动性疲劳中起着重要的作用[4]，由于肌肉是运动的最直接部位，其能量消耗剧烈，局部耗氧增多，因而在运动中及运动后肌肉中自由基迅速增多，同时消耗大量抗氧化酶。研究表明：肌肉是机体抗氧化酶活力最低的组织之一，但其在运动中血流量能增加几十倍，氧耗的急剧增加造成了氧自由基的大量生成。这些骤然增多的自由基与生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应而引起膜结构的改变，严重时即有肌细胞肿胀、坏死等改变。SOD作为体内的抗氧化酶，可反映清除自由基的能力。MDA作为脂质过氧化反应产物，其含量能间接反映机体内自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度。本实验中，运动组小鼠腓肠肌SOD活性降低，MDA含量增加，提示在长时间剧烈运动导致小鼠腓肠肌中自由基大量生成，脂质过氧化反映增加，这与文献报导基本相一致[5-6]。林蛙油组小鼠运动后腓肠肌SOD活性高于运动组，MDA含量低于运动组。表明补充林蛙油可降低脂质过氧化反应，提高机体的抗氧化能力，减轻运动引起的腓肠肌细胞的损伤。

许多学者研究发现，经过急性力竭或剧烈运动后，电镜结果表明，骨骼肌组织形态结构的变化表现为，肌节排列不整，线粒体出现髓样化、嵴断裂、缺失，部分线粒体可见明显水肿现象等[7-8]。本研究结果表明，小鼠力竭运动后，也有相似的结构变化，补充林蛙油可使腓肠肌细胞损伤减轻。这可能是林蛙油能提高腓肠肌细胞SOD活性和降低MDA含量，有利于自由基的清除。表明林蛙油具有保护腓肠肌细胞正常结构，增强机体防御体系的功能，进而防止运动性损伤及提高运动能力，也为林蛙油的深度开发提供理论和实验依据。

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