紫背天葵总黄酮分离纯化工艺的研究

2013-07-22李巧云洪小谷

食品研究与开发 2013年12期

李巧云，洪小谷

（1.闽南师范大学成人教育学院，福建漳州 363000；2.漳州市环境监测站，福建漳州 363000）

紫背天葵（Begonia fimbristipula），学名紫背菜，又称红凤菜，此菜口感鲜嫩，营养丰富，具有充足的维生素群和矿物质，经常食用具有中医食疗保健的神奇疗效，可清热解毒、消炎消肿、止咳润燥[1]，近年来还发现其组成成分中含有具有生物活性的可以抗肿瘤以及恶性细胞增长的黄酮类化合物[2]，能够延缓衰老。目前提取和分离纯化黄酮类化合物的工艺很多，AB-8 大孔树脂具有良好的吸附性能，解吸方便，能够避免无机物的影响，可循环再生使用，作为一种新型的分离技术[3-8]目前已被广泛用于银杏等多种植物黄酮类化合物的分离提纯中，但在紫背天葵总黄酮的提取中还鲜见报道。通过研究静态吸附中吸附的时间，样液的pH 以及溶剂的体积分数和温度，解吸附中乙醇的体积分数等单因素试验，得出大孔吸附树脂对紫背天葵总黄酮的最佳分离纯化条件；同时研究大孔树脂对总黄酮样液的解吸曲线，掌握黄酮类化合物的吸收区段，从而为将来对紫背天葵中黄酮的组分进行性质鉴定提供相关的实验参考。

1 材料与设备

1.1 试验材料

紫背天葵：本地产，采自于漳州师范学院植物园内；

主要试剂：亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯AR；芦丁对照品由中国药品生物制品检定所提供；AB-8 大孔吸附树脂。

1.2 试验仪器

HH-4 型数显恒温水浴锅、85-2 型恒温磁力搅拌器：江苏金坛江南仪器厂；752P 型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器；HH-4 型电动粉碎机：天津泰斯特；SHB-III 型循环水式多用真空泵：郑州长城科技；R307型旋转蒸发仪：上海生申科技；BSZ-100 型自动部分收集器：郑州南北仪器；BSⅡOS 型电子分析天平：赛多利斯；DHG-9053A 型电热鼓风干燥箱：上海成顺；KH-100SP 型双频数控超声波清洗器：昆山超声仪器；100-1000 ul/1-5 ml 微量可调单道移液器：芬兰雷柏。

2 试验方法

2.1 样品制备

紫背天葵全草洗净，于80 ℃烘干，将已经干燥的紫背天葵放入电动粉碎机中进行粉碎，过40 目筛，得到干燥粉末。

2.2 紫背天葵黄酮类化合物提取方法

精确称取10 g 的紫背天葵样品粉末置于圆底烧瓶中，用300 mL 的70%乙醇溶液在60 ℃的水浴中浸提2 h，趁热抽滤。依法多做3 次以制备更多的黄酮粗提液，合并滤液。将得到的滤液在65 ℃下进行旋转蒸发浓缩，所得到的浓缩液用70%乙醇定容至200 mL，得到紫背天葵黄酮类化合物粗提液。冷藏保存备用。

2.3 紫背天葵黄酮类化合物测定方法

2.3.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标品80 mg，用体积分数70%乙醇微热溶解，冷却后转移至100 mL 容量瓶中并定容至刻度，充分摇匀，得到0.8 mg/mL 标准溶液。精密吸取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加质量分数5 %NaNO22.0 mL，摇匀、放置6 min 后，加质量分数10 %AlNO32.0 mL，摇匀，放置6 min，再加质量分数4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分摇匀，放置15 min，以空白试剂做参比液，用分光光度计在510 nm 处测定吸光度[20]，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度值A 为纵坐标，绘制出标准曲线，求出回归方程。

2.3.2 总黄酮类化合物含量的测定

精密吸取粗提液5.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，加质量分数5%NaNO22.0 mL，摇匀、放置6 min 后，加质量分数10%AlNO32.0 mL，摇匀，放置6 min，再加质量分数4%NaOH 20 mL，最后加70%乙醇定容至刻度，充分摇匀，放置15 min，以空白试剂做参比液，用分光光度计在510 nm 处测定吸光度[3]，按照标准曲线所得回归方程计算浓度，再根据公式（1）计算紫背天葵总黄酮的提取率[4]。

式中：C 为黄酮类化合物的质量浓度，（mg/mL）；V1为原提取液体积，mL；D 为提取液稀释的倍数（实验中D=125）；M 为提取用的紫背天葵粉末的质量，g。C 可依据所测溶液的吸光度值A510，代入回归方程算出其值。

2.4 大孔吸附树脂的预处理及其性能指标测定

2.4.1 树脂预处理

称取一定量的AB-8 大孔吸附树脂，先用95%的乙醇浸泡24 h，然后用乙醇洗脱，收集部分洗出液，加水检验，当洗出液在加水时无白色混浊现象时可停止乙醇洗涤，接着用去离子水将大孔树脂的乙醇洗尽，加入5%盐酸，浸泡3 h，再用去离子水将大孔树脂清洗，直至中性时停止，加入5 %氢氧化钠溶液，浸泡3 h，同法洗至中性停止，过滤，注意尽量将去离子水滤干，预处理完毕。将处理好的大孔吸附树脂至于真空泵内抽气，备用[5]。

2.4.2 静态吸附率的测定

称取已经预处理完毕的大孔吸附树脂2 g，置于100 mL 三角烧瓶中，接着加入30 mL 样品粗提溶液，放置台式恒温振荡器中，室温下振荡24 h，待其充分吸附后，过滤，按照2.3.2 方法，测定过滤后的滤液中总黄酮的浓度[6]，并根据下列公式（2）测定静态吸附率。

式中：C1为吸附浓度，（mg/mL）；C2为吸附后剩余液浓度，（mg/mL）。

2.4.3 解静态吸附的测定[7]

在静态吸附的饱和大孔树脂中，加入50 mL 95%乙醇溶液，放置台式恒温振荡器中，室温下振荡24 h，待其充分解吸附后，过滤，按照2.3.2 方法，测定过滤后的滤液中总黄酮的浓度。并根据公式（3）计算洗脱率。

2.5 分离参数优化研究

2.5.1 树脂分离实验操作

称取AB-8 大孔吸附树脂100 g，用95%乙醇湿法装柱，将树脂全部装入层析柱（40 mm×30 cm）中，接着准确量取10 mL 紫背天葵黄酮粗提液，将提取液用大孔吸附树脂的交换柱吸附，等待其完全吸附后用去离子水洗脱，接着再用95%的乙醇解吸，利用自动部分收集器进行收集，注意控制流速，每管收集3 mL 为宜，并将试管编号，按照以上步骤收集后，分别吸取1 mL 收集液，并测量它们的吸光度值。根据所测得的数据制作AB-8 大孔吸附树脂柱层析的色谱图，通过该图谱我们还可以分析出紫背天葵中黄酮类物质的种类。

2.5.2 单因素试验

分别改变静态吸附的条件，即在其他条件不变的情况下，分别改变吸附的时间、样液的pH 以及吸附时的温度[8]，按照上述2.4.2 中的方法对紫背天葵中黄酮类化合物进行吸附，考察它们对吸附效果的影响。得到最佳工艺参数，并根据公式（3），确定最优洗脱率。

2.5.3 正交试验

根据单因素的实验结果，对影响黄酮类化合物吸附效果的3 个因素，选取A：样液的pH（5.0、6.0、7.0）、B：吸附温度（20、25、30 ℃）、C：吸附时间（4、8、12 h）进行L9（33）正交试验。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factor and level of orthogonal experiment

3 结果与分析

3.1 样品粗提液总黄酮的含量

根据试验所得标准曲线回归方程y=10.782x+0.011 4（r2=0.998 5）计算样品液浓度，结果在510 nm 下测得紫背天葵总黄酮粗提液的吸光度值为y=0.212，经计算可得粗提液浓度x=0.018 65 mg/mL，所得的200 mL粗提液中黄酮的总浓度为0.932 4 mg/mL，相对紫背天葵样品粉末黄酮含量为0.47%。

3.2 静态吸附率的测定

根据试验2.4.2 及标准曲线回归方程计算，滤液中黄酮类化合物的吸光度值y2=0.107，可计算吸附后黄酮的浓度C2=0.008 9 mg/mL，代入公式（2），可得出样品溶液的吸附率为52.2%。

3.3 静态解吸附的洗脱率

根据3.2 所得的结果以及2.4.3 的步骤，将充分解吸后所得的黄酮类化合物的吸光度值y=0.077 代入标准曲线回归方程中，经换算成洗脱液黄酮的含量为0.006 1 mg/mL，代入公式（3），可得出样品溶液的洗脱率为62.7%。

3.4 紫背天葵总黄酮的动态研究以及动态曲线

按照试验2.5.1 所述方法进行试验，收集共39 支试管的解吸液，分别取1 mL 测定它们的吸光度值，在作出AB-8 柱层析的色谱图，见图1。

图1 AB-8 柱层析色谱图Fig.1 AB-8 column chromatography chromatograms

由图1 可以看出，经过AB-8 大孔树脂吸附黄酮类化合物所得出的色谱分析图只出现了一个吸收峰，这说明紫背天葵中黄酮的种类大致相同，故为将来进一步鉴定紫背天葵黄酮的性质奠定了基础，无需再分开收集紫背天葵中的黄酮类物质。

3.5 不同因素对紫背天葵总黄酮纯化影响的研究

根据试验2.5.2 所述方法分别改变静态吸附的条件，即在其他条件不变的情况下，分别改变吸附的时间、样液的pH 以及吸附时的温度，对紫背天葵中黄酮类化合物进行吸附，考察它们对吸附效果的影响。得到最佳工艺参数。

3.5.1 吸附时间

在不改变样液pH 和吸附温度的情况下考察时间对吸附率的影响，考察1 h～10 h 内所收集的各样液的吸光度值，并制作出时间-吸光度值关系曲线，得到结果如图2。

图2 吸附时间对吸附率的影响Fig.2 Effect of aborsobing time on the absorbing capacity

由图2 可以看出，在一定的时间内，随着时间的延长，吸光度值逐渐降低，说明黄酮被AB-8 大孔树脂吸附之后浓度逐渐开始降低，树脂的吸附率增加，但是到达一定的时间之后，吸附率就稳定在一个状态中不再增加，这是因为大孔树脂的吸附量已趋于饱和，在这种情况下树脂将不再吸附，吸附率就不再变化了。因此，我们可以认为AB-8 大孔吸附树脂吸附紫背天葵总黄酮的最佳时间应控制在7 h～8 h。

3.5.2 原料液pH 对吸附率的影响

原样液的pH 为6.3，我们用5 %的氢氧化钠和1 mol/L的盐酸将样液的pH 分别调至4.0、5.0、6.0、7.0各30 mL，然后分别加入2 g AB-8 大孔吸附树脂。置于震荡器上24 h，过滤得到滤液，测定滤液中黄酮的吸光度值，并制作出pH 与吸光度值的关系曲线，得到结果见图3。

由图3 可以看出，样液的pH 为6 的时候，吸附效果是最好的，这是因为根据大孔树脂的吸附原理，吸附过程中吸附介质以分子状态被吸附，保持好吸附介质的分子状态是保证良好吸附效果的基础。在一般情况下，溶液为酸性时，吸附效果最好，但这个酸度仅限于弱酸，酸性太强时，可能会导致吸附物质化学结构产生变化。

图3 pH 对吸附率的影响Fig.3 Effect of pH on the absorbing capacity

3.5.3 温度对吸附量的影响

分别取原样液30 mL 4 份，加入AB-8 大孔吸附树脂2 g，在pH 保持6.3 的情况下置于恒温震荡器上振荡24 h，温度分别设置为20、25、30、35 ℃，24 h 后过滤出滤液，测定滤液中黄酮的吸光度值，并制作出温度与吸光度值的关系曲线，得到结果见图4。

图4 温度对吸附率的影响Fig.4 Effect of temperature on the absorbing capacity

从图4 我们看出，当温度在25 ℃时，大孔吸附树脂吸附紫背天葵总黄酮的吸附量比其他3 个温度的吸附量更高，且温度适中，基本能够保证黄酮的性质不因温度因素而发生变化，在实验中25 ℃接近室温容易控制，故我们可以将AB-8 大孔吸附树脂吸附紫背天葵总黄酮的温度确定在25 ℃[8]。

3.6 紫背天葵总黄酮纯化最佳工艺的研究

紫背天葵总黄酮纯化最佳工艺的研究见表2。

由表2 结果可知，RB＜RA＜RC，即条件B（吸附温度）对紫背天葵黄酮类化合物吸附效果的影响最大，A（pH）其次，影响最弱的是C（吸附时间）。因此可下结论，当A2B2C3的情况下，即pH 为6，吸附温度25 ℃、吸附时间12 h 时，AB-8 大孔树脂紫对背天葵总黄酮的吸附率较高。但是由于单因素试验时，吸附时间8 h 和12 h 吸附效果差别不大，而正交实验表明吸附时间对吸附率的影响也最弱，为了节约时间和资源能效，我们还是将pH 为6，吸附温度25 ℃、吸附时间8 h 确定为最佳纯化的工艺条件。