茶树菇多糖提取的复合酶制剂筛选及工艺研究

周瑶，毛淑红，孙祺，华伯元，王娜，胡晓杰，刘莎，路福平，*

（1.工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学），天津 300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津 300457；3.工业酶国家工程实验室，天津 300457；4.天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学，天津 300457）

食用菌是一类营养丰富并有很高食用和药用价值的大型真菌总称[1]，它作为一类高蛋白、低脂肪、营养价值很高的绿色食品日益受到全世界的重视，并成为保健食品的重要功能因子[2-4]，因此社会对食用菌的研究也越来越深入。食用菌富含多糖、维生素、氨基酸等天然活性成分，其中多糖是一类具有某种特殊生物活性的化合物，具有免疫调节功能[5]、抗肿瘤[6]、延缓衰老、降血糖[7]、抗血栓作用等。

茶树菇（Agrocybe aegerita）又叫茶薪菇，杨树菇，柱状田头菇，柳松茸等，属于真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属，民间晒干后用于头晕、头痛、呕吐及小儿低烧、老人气喘等症状的治疗，因此被人们称为“菇中珍品”，享有“中华神菇”，“神仙菇”之称。现代医学研究证明,其可滋阴壮阳，对肾虚、尿频、水肿、癌症、高血压、早衰及小儿低热、尿床等都有较理想的辅助治疗功能[8]。茶树菇是一种富含多糖的高蛋白﹑低脂肪，矿物质含量相对较高，营养价值很高的食用菌。茶树菇多糖的提取方法主要包括热水提取法、超声波提取法、微波提取法和酶法，水提法虽然简单经济，但是多糖的得率较低，超声波提取法和微波提取法在传统的方法上多糖提取率有所提升，但是增幅不大，而且对多糖结构也有一定破坏，酶法技术具有高效、无毒、反应条件温和等优点[9-10]。本实验采用两种复合酶分步酶解法获得营养物质，为茶树菇的深加工提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外可见分光光度计，离心分离机，pH 酸度计，电热恒温水浴锅，恒温干燥箱,微量滴定管，电子分析天平，循环水式多用真空泵，高速组织粉碎机等。

硫酸为国产分析纯；纤维素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，木瓜蛋白酶，果胶酶（天津滨海诺奥酶工程技术有限公司，酶活性：≥80 U/mg）；干茶树菇子实体（购于市场,制成80 目粉末）。

标准溶液的配制：精确称取干燥恒重葡萄糖100mg，置于100mL容量瓶中用蒸馏水定容，得浓度为1 mg/mL。葡萄糖贮备溶液，再准确移取20 mL，用蒸馏水定容至100 mL，得0.2 mg/mL 的葡萄糖使用液。

苯酚溶液的配制：苯酚（纯苯酚为针状无色结晶），水浴加热后称取100 g，加铝片0.10 g、加入氢氧化钠0.05 g，蒸馏收集178 ℃～182 ℃的馏分，取馏出液10.0 g，加入水190 mL，得5%的苯酚溶液，置于棕色瓶中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制

吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 比色管中,分别加入蒸馏水0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL，各加5%的苯酚溶液1 mL 后，再加入浓硫酸5 mL，摇匀放置冷却，补加蒸馏水到刻度。另取10 mL比色管加入蒸馏水1 mL，加5%的苯酚溶液1 mL，然后加入浓硫酸5mL，按上述方法制得空白溶液，在490nm处测定吸光度。以糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。经计算回归方程为Y=0.0061x-0.006 6，相关系数R=0.998 8。

1.2.2 茶树菇多糖的提取及含量测定

称取10 g 茶树菇粉末，置于100 mL 三角烧瓶中，加入蒸馏水10 mL,分别加入各种浓度的酶，并调节初始pH、温度、反应时间，得到茶树菇提取液。加入3 倍体积的乙醇，静置于4 ℃冰箱24 h；离心（6 000 r/min、10 min），取沉淀，加10 mL 蒸馏水溶解；Sevag 法[11]除蛋白，取上清液，加水稀释取样用苯酚硫酸法[12]测量茶树菇多糖的含量。

1.2.3 利用复合生物酶制剂分步制取茶树菇水解液的工艺

2 结果与分析

2.1 一次酶解过程中水解茶树菇条件的确定

2.1.1 单因素实验

采用单因素试验确定酶浓度，水解时间，初始pH，水解温度以及料液比对茶树菇的水解程度，并测定其水解液中多糖的含量，以此选择复合酶水解试验的条件依据。

2.1.1.1 酶添加量对茶树菇水解影响

每组称取茶树菇子实体粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），温度50 ℃，在初始pH 为4.5 时分别加入不同的酶，纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，添加量分别0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，酶解2 h，升温灭酶，检测水解液中多糖含量，酶添加量对茶树菇水解液中多糖含量的影响如图1 所示。

图1 酶添加量对茶树菇水解液中多糖含量的影响Fig.1 Enzyme concentration for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如图1 所示，随着酶添加量的增加茶树菇水解液中的多糖含量也随着增加，当酶添加量增加到0.15%时茶树菇水解液中的多糖含量也达到峰值，再增加酶添加量茶树菇水解液中的含量也没有明显增加。

2.1.1.2 初始pH 对茶树菇水解液的影响

每组称取茶树菇子实体粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），温度50 ℃，在初始pH 为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 时分别加入纤维素0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，进行酶解，酶解2 h，升温灭酶，检测水解液中多糖含量，pH 对茶树菇水解液中多糖含量的影响如图2 所示。

图2 pH 对茶树菇水解液中多糖含量的影响Fig.2 pH for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如图2 所示，随着pH 变大茶树菇水解液中的多糖含量也随着增加，当pH 达到4.5～5 时茶树菇水解液中的多糖含量也达到峰值，之后再增大pH 茶树菇水解液中的多糖含量逐渐降低。

2.1.1.3 酶解时间对茶树菇水解液的影响

每组称取茶树菇子实体粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在温度50 ℃时分别加入纤维素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，进行酶解，在初始pH 为4.5 时，分别酶解1、2、3、4、5 h，升温灭酶，检测水解液中多糖含量，酶解时间对茶树菇水解液中多糖含量的影响如图3 所示。

图3 酶解时间对茶树菇水解液中多糖含量的影响Fig.3 Time for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如图3 所示，随着酶解时间的增长茶树菇水解液中的多糖含量也随着增加，当酶解时间达到3 h 时茶树菇水解液中的多糖含量也达到峰值，再延长酶解时间茶树菇水解液中的含量也没有明显增加。

2.1.1.4 酶解温度对茶树菇水解液的影响

每组称取茶树菇子实体粉末10 g，料液比1∶10（g/mL），在40、45、50、55、60 ℃不同温度时，分别加入纤维素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，进行酶解，在初始pH 为4.5 时酶解2 h，升温灭酶，检测水解液中多糖含量，酶解温度对茶树菇水解液中多糖含量的影响如图4 所示。

图4 酶解温度对茶树菇水解液中多糖含量的影响Fig.4 Temperature for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如图4 所示，随着酶解温度增加茶树菇水解液中的多糖含量也随着增加，当酶解温度达到45 ℃～50 ℃时茶树菇水解液中的多糖含量也达到峰值，之后再增加酶解温度茶树菇水解液中的多糖含量逐渐降低。

2.1.1.5 料液比对茶树菇水解液的影响

每组称取茶树菇子实体粉末10 g，在温度50 ℃时分别加入纤维素酶0.15%，木聚糖酶0.15%，β-葡聚糖酶0.20%，在初始pH 为4.5 时，酶解2 h，分别选择料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），升温灭酶，检测水解液中多糖含量，料液比对茶树菇水解液中多糖含量的影响如图5 所示。

图5 料液比对茶树菇水解液中多糖含量的影响Fig.5 Material/liquid ratio for influence of polysaccharide amount in A.aegirit hydrolysate

如图5 所示，随着料液比增加茶树菇水解液中的多糖含量也随着增加，当料液比达到1∶20（g/mL）时茶树菇水解液中的多糖含量也达到峰值，之后再增大料液比值茶树菇水解液中的多糖含量逐渐降低。

2.1.2 复合酶I 的正交试验

由于茶树菇的细胞壁是由蛋白质、几丁质、纤维素组成，较坚固，为了更好地使是蛋白质和多糖等溶出，又不使成本过高，采用纤维素酶，β-葡聚糖酶和木聚糖酶共同作用，以提高茶树菇细胞壁的破碎率。

在使用纤维素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶共同作用时，由于通过单因素试验可知纤维素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶的最佳作用浓度分别为0.15%，0.15%及0.20%，我们以前两者用量为0.15%作为基准，后者分别以0.15%，0.20%，0.25%，0.30%与之进行复配，在单酶试验的基础上，同时又考虑了复合酶I 的水解初始pH，水解时间和水解温度的影响，选用L16（54）进行正交试验，正交试验因素水平如表1。以水解液中多糖含量为考察指标，分析试验结果，确定复合酶I 水解茶树菇的最适条件。

表1 复合酶I 正交试验L16（54）因素与水平Table 1 the orthogonal experiments of Composite enzyme I factors and level

由表1 可知，各因素的主次顺序依次是A、C、B、D、E，最佳的水平条件组合为A4B2C3D2E2。通过正交试验得到复合酶I 提取茶树菇多糖的最佳工艺条件为：纤维素酶∶木聚糖酶∶β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 为5.0，酶解时间2 h，酶解温度50 ℃，料液比为1∶20（g/mL）。在此条件下茶树菇水解液中的多糖含量为197.65 mg/g。

2.2 二次酶解水解茶树菇条件的确定

在使用木瓜蛋白酶，果胶酶共同作用时，以前者用量为0.20%作为基准，后者分别以0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的添加量与之合用，在单酶实验的基础上，同时又考虑了复合酶II 的水解初始pH，水解时间和水解温度的影响。以水解液中多糖含量为考察指标，分析试验结果，确定复合酶II 水解茶树菇提取多糖的最适条件。

通过正交试验得到复合酶II 提取茶树菇多糖的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶∶果胶酶=4∶6，酶解温度55 ℃，酶解时间2 h，pH 为4.0，料液比为1∶40（g/mL）。在此条件下茶树菇水解液中的多糖含量为201.86mg/g。

3 结论

采用两种复合酶制剂进行茶树菇多糖的提取，通过正交试验筛选出了复合酶制剂的最佳组合：一次酶解的最优条件为纤维素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 为5.0，酶解时间2 h，酶解温度50 ℃，料液比为1∶20（g/mL）。二次酶解的最优条件为木瓜蛋白酶∶果胶酶=4∶6，酶解温度55 ℃，酶解时间2 h，pH 为4.0，料液比为1∶40。此次实验，我们采用的复合酶制剂分步水解的方法与其它实验相比，可以明显提高多糖的提取率，多糖含量较其它也有显著升高。比较一二次酶解效果，经过二次酶解后多糖含量比一次酶解后的多糖含量没有明显的增加，说明二次酶解并没有使多糖物质更多的释放，但是经过二次酶解后其它的生物活性物质（如：α-氨基氮等）较一次酶解后都有大幅度的提升。从经济利益方面考虑，最终确定茶树菇提取多糖的复合酶制剂配方为一次酶解的最优条件，即纤维素酶：木聚糖酶：β-葡聚糖酶=3∶3∶6，pH 为5.0，酶解时间2 h，酶解温度50℃，料液比为1∶20（g/mL）。

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