高效液相色谱法测定食用菌中甲醛的方法研究

2013-12-02鲁燕骅杨丽仙牛华祝红昆珠娜

食品研究与开发 2013年2期

鲁燕骅，杨丽仙，牛华，祝红昆，珠娜

（1.云南省产品质量监督检验研究院，云南昆明 650223；2.云南省计量测试技术研究院，云南昆明 650228）

甲醛是一种具有强烈刺激性的无色气体，易溶于水，其溶液常作为防腐剂。甲醛的稀释溶液能使细胞原生质的蛋白质发生不可逆凝固，并能使细胞的正常机能受到抑制，甚至破坏，是一种原生质毒物。近几年，我们在日常检测工作中发现有不法从业者使用甲醛溶液对食用菌进行防腐处理，以延长食用菌的销售周期，对食用者的健康产生极大威胁。目前，甲醛的测定方法有：分光光度法，该方法具有操作简单等优点，其缺点是定性准确度不够，易产生假阳性；液相色谱法，均采用样品直接衍生的处理方式，干扰较大，影响定量的准确性；气相色谱法，其缺点是稳定性和重现性不够好。

本方法中样品经水蒸汽蒸馏，得到的蒸馏液经柱前衍生，样品中的甲醛与2，4-二硝基苯肼进行衍生化反应，生成甲醛-二硝基苯腙，用液相色谱进行分离，二极管阵列检测器外标法定量测定，该物质在350 nm下有最大吸收。该方法能够有效降低干扰，准确度高，精密度好。

1 材料与方法

1.1 设备

安捷伦HP1100高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）：安捷伦；蒸馏装置（含冷凝、接收装置）。

1.2 试剂

甲醛：标准品，100 mg/L购自国家标物中心，使用前根据检测要求稀释成相应的标准工作溶液；乙腈（色谱纯）；2，4-二硝基苯肼（分析纯）；磷酸（分析纯）；水为超纯水（18.2 MΩ）。

1.3 试剂配制

1.3.1 0.3%2，4-二硝基苯肼溶液

称取0.3 g 2，4-二硝基苯肼，用70 mL 85%磷酸溶解，用乙腈定容至100 mL（2，4-二硝基苯肼预先用25%乙腈溶液重结晶，提纯。

1.3.2 10%磷酸溶液（体积比）

取10 mL磷酸至100 mL容量瓶，一边摇动一边缓慢加入水定容至刻度线。

1.4 方法

1.4.1 提取

称取10 g样品（精确到0.001 g）于50 mL烧杯中，加水30 mL 10%磷酸10 mL进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液至100 mL。

1.4.2 衍生

移取上述馏出液10 mL至预先盛有20 mL乙腈的50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 0.3%2，4-二硝基苯肼，用蒸馏水定容至刻度线，常温下静置4 h。经0.45μm滤膜过滤后待测。

1.4.3 测定色谱条件

色谱柱：C18，200 mm×4.6 mm，5μm；检测波长：350 nm；流动相：乙腈∶水=60∶40；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20μL。

2 结果与讨论

2.1 提取

样品经磷酸酸化，水蒸气蒸馏，已能将样品中的甲醛完全蒸馏出来，若采用直火蒸馏，会使食用菌中糖类物质分解成甲醛，影响测定结果。

2.2 衍生化反应

2.2.1 反应时间

衍生化反应后 2 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进行测定，发现该反应在4 h后达到稳定值。

2.2.2 衍生试剂浓度

用0.1%、0.2%浓度的衍生试剂，反应12 h后，仍达不到一个平衡点，而用0.3%～0.4%浓度的衍生试剂衍生后，反应3 h～6 h，反应趋于稳定状态。

2.2.3 衍生化反应温度

分别在 10、20、30、40、60、80 ℃下进行衍生化反应，发现10、20、30℃下衍生化反应基本完全，当温度＞40℃时，衍生反应的效率有所下降，故本方法选择在室温下进行衍生化反应。

2.2.4 衍生化反应pH

当pH小于4时，可以抑制苯肼成盐，保留一部分游离碱，使反应顺利进行，通过对pH为1、2、3、4进行试验，发现pH越低，反应速度越快，反应产物也相对偏高，但对于普通C18色谱柱来说，其使用范围一般在pH 2～10之间，故从检测效率，仪器维护，操作方便性等方面考虑，本方法采用0.3%的衍生试剂，pH=3的条件常温下衍生反应4 h后进行测定。

2.3 检测波长的选择

经二极管阵列检测器波长扫描，甲醛-2，4二硝基苯腙在350 nm处有较大吸收。

2.4 流动相的选择

选用乙腈∶水=60∶40（体积比）为流动相，可获得较好的峰形和适当的保留时间（见图1），连续10次进样，保留时间的RSD＜0.5。

图1 标准样品图谱Fig.1 Standard sample diagram

2.5 方法线性关系和检测限

将甲醛标准溶液分别稀释成含甲醛：5、10、20、30、40、50μg的系列标准，在本方法所确定的实验条件下进行测定，并绘制标准曲线，在此范围内，甲醛量与峰面积具有良好的线性关系，线性方程：y=4.551x+0.507，相关系数r=0.9999，甲醛的最小检出量为2×10-8g，对于10 g样品，最低检出浓度为0.02 mg/kg。