西红花花瓣总黄酮提取及抗氧化性研究

赵成刚，瞿伟菁

（1.铜仁学院生物科学与化学系，贵州铜仁 554300；2.华东师范大学生命科学学院，上海 200062）

药典载西红花Stigma croci，为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头[1]。性味与归经：甘、平。归心，肝经。功能与主治：活血化瘀，凉血解毒，解郁安神。用于经闭症瘕，产后瘀阻，温毒发斑，忧郁痞闷，惊悸发狂[2]。现代药理学研究表明西红花对肿瘤及癌症[3-5]、冠心病[6]、肝炎及肝硬化[7]、高血脂症[8]等多种疾病具有较好的防治作用。其药用部位为柱头，产量极低。

西红花花瓣是制药工业中的副产品，已有学者从中分离得到类黄酮、皂甙等物质[9-10]，表明西红花花瓣含有多种活性成分。现代药理药效显示：具有抗忧郁症和降动脉血压的作用[11-12]，此外，未见其他相关报道。我们前期研究发现西红花花瓣中富含总黄酮和多糖等活性成分，其含量及生理活性，均具有形成产品的优势。本研究使用的西红花花瓣是去掉花柱后的弃物，为实现资源深度开发、利用，从天然产物化学角度对西红花花瓣总黄酮（Flavones from Petals ofCrocus Sativus，FPC）成分提取分离技术及其体外抗氧化能力进行研究，为利用FPC工业化生产黄酮类药用成分提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

西红花花瓣：由浙江寿仙谷药业有限公司提供（去掉花柱后的干燥花瓣）。于56℃烘干至恒重，粉碎成粉，过30目筛，石油醚脱脂，置干燥箱干燥后密封袋中避光备用。

1.1.2 试剂

山奈酚标准品、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrayl，DPPH）：sigma 公司；甲醇（色谱纯）；石油醚（分析纯）；水杨酸（分析纯）。

1.2 仪器与设备

BS210S电子天平：Sartorius；RE-52型旋转蒸发仪：上海医械专机厂；UV-VIS7500紫外/可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海锦华层析设备厂；ZK-82A型真空干燥箱：上海实验仪器总厂；Bio-tek exl 800酶联免疫测定仪：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FPC的提取工艺

工艺流程：西红花花瓣→恒温干燥→粉碎、过筛（30目）→精密称量→石油醚脱酯→乙醇提取→过滤→定容→FPC提取液

1.3.2 总黄酮含量的测定

1.3.2.1 吸收波长的选择

把山奈酚标准品与西红花提取液按照一定比例稀释后，用分光光度计在200 nm～600 nm范围内进行波长扫描，以甲醇为空白试剂，结果提示，供试品与山奈酚标准品均在365 nm处有最大吸收故确定其为检测波长。

图1 山柰酚标品与样品全波长扫描图Fig.1 Full wavelength scanning chart of kaempferol and FPC

1.3.2.2 标准曲线的制备

在参照方法[13-14]的基础上，有所改进。准确配制1 mg/mL的山奈酚标准液，取0.2 mL定容至5 mL，再分别取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 进行测定，以山奈酚含量C为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作标准曲线，计算机处理得回归方程为：A=43.115C+0.006 7，R2=0.999 7。

1.3.2.3 样品液制备和总黄酮得率的计算

图2 山柰酚标准曲线Fig.2 Standard curve for kaempferol determination

精密量取1.3.1中FPC提取液0.2 mL用甲醇定容于5 mL试管中，并用相应体积的甲醇作对照，按照1.3.2.2方法通过回归方程计算相应的总黄酮质量浓度。

1.3.3 试验设计

1.3.3.1 单因素试验

分别研究乙醇浓度、提取温度、提取时间、提取次数、料液比对FPC含量的影响，重复3次。

1.3.3.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，在选定料液比为1∶30的前提下，选取乙醇浓度、提取次数、提取时间、提取温度为试验因素进行四因素三水平正交试验设计，重复3次，见表1。

表1四因素三水平正交试验设计[L9（34）]Table 1Four factors three levels by orthogonal design L9（34）

1.3.3.3 对DPPH自由基清除能力试验

配置浓度分别为 1、2、4、8、10、16 mg/mL 的 FPC溶液。在1.9 mL，0.065 mmoL的DPPH乙醇溶液[15]中加入0.1 mL不同浓度的样品溶液。反应30 min，于517 nm下测定吸光度Ai。以相应溶剂代替样品作为空白对照，吸光度为Amax。

·DPPH 清除率/%=（1-Ai/Amax）× 100

1.3.3.4 羟基自由基（·OH）清除能力试验

参照Fenton反应方法[16]建立·OH自由基产生体系模型。在试管中依次加入6 mmoL/L FeSO4溶液2 mL，多糖溶液 2 mL，6 mmoL/L H2O2溶液 2 mL，静置10 min。再加入6 mmoL/L水杨酸溶液2 mL，静置30 min后于510 nm处测吸光度A0，用蒸馏水代替样品溶液测得吸光度Ax。

·OH 清除率/%=（1-A0/Ax）× 100

1.3.4 数据处理

数据以“±s”表示。

2 结果与分析

2.1 FPC提取工艺

2.1.1 乙醇浓度对浸提效果的影响

称取5.00 g干燥后的西红花花瓣粉末5份，分别加入乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液各100 mL，在提取温度为70℃，提取时间1.0 h，料液比为1∶20的条件下进行提取，见图3。

图3 乙醇浓度对得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield

由图3可知，在较低乙醇浓度下得率较高，随乙醇浓度升高得率反而下降，故选取较低的乙醇浓度进行提取。

2.1.2 提取温度对浸提效果的影响

为考察提取温度对西红花花瓣黄酮得率的影响。分别称取5.00 g干燥后的西红花花瓣粉末6份，分别加入乙醇浓度70%的乙醇溶液，提取时间1.0 h，料液比为 1∶20，在提取温度为 30、40、50、60、70、80 ℃的条件下进行提取，见图4。

图4 提取温度对得率的影响Fig.4 Effect of temperature on the yield

由图4可知，随着提取温度的升高，黄酮得率不断增加。在30℃～60℃时黄酮得率增加比较快，之后得率增加变缓，在60℃过后黄酮得率达到较高水平，故可以从该范围选取适宜提取温度。

2.1.3 提取时间对浸提效果的影响

选取合适的提取时间既能较好的提高得率，又能节约能源，从而降低成本。分别称取5.00 g干燥后的西红花花瓣粉末4份，分别加入浓度70%的乙醇溶液，提取温度 70 ℃，料液比为 1∶20，在提取时间为 1、2、3、4 h的条件下进行提取见图5。

图5 提取时间对得率的影响Fig.5 Effect of time on the yield

由图5可知，在1 h～2 h内黄酮得率增加较快，之后增加变缓，从节约成本等方面考虑，提取时间不宜过长。

2.1.4 料液比对浸提效果的影响

分别称取5.00 g干燥后的西红花花瓣粉末4份，分别加入浓度70%的乙醇溶液，提取温度70℃，提取时间 1 h，在料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 的条件下进行提取见图6。

图6 料液比对得率的影响Fig.6 Effect of the ratio of sample to water on the yield

由图6可知，随着料液比的增加，黄酮得率随之增加。主要是由于溶剂中溶质的浓度差和能够溶解物质的量都不断增大的缘故。在1∶30后增大溶剂用量，得率增加不显著，同时浓缩的难度加大，从节约能源方面考虑，溶剂体积不宜过大。

2.1.5 提取次数对浸提效果的影响

分别称取5.00 g干燥后的西红花花瓣粉末4份，分别加入浓度70%的乙醇溶液，在提取温度70℃，料液比为1∶20，提取时间为1 h的条件下分别提取1次、2次、3次、4次见图7。

图7 提取次数对得率的影响Fig.7 Effect of extraction times on the yield

由图7可知，随着提取次数的增多，黄酮得率也随之增加。

2.2 正交试验结果分析

正交试验结果分析见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Result of orthogonal test

结果表明，因素提取次数试验组的极差最大，达到2.429，醇提浓度其次，提取温度次之。即4种考察因素对FPC提取效果影响的主次顺序为：提取次数＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间；根据正交试验结果可知，FPC提取的最佳提取工艺为：乙醇浓度为60%，提取温度为70℃，提取时间为2 h，提取次数为3次。

2.3 验证性实验

精密称取西红花花瓣粉末5.00 g，共5份，按最佳提取工艺条件提取，进行验证试验，测得平均总黄酮含量为20.451 mg/g，RSD为0.591%，可见该工艺稳定可行。

2.4 对DPPH自由基清除能力的测定

·DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，含有单个电子，其乙醇水溶液呈紫色。有自由基的清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降。FPC对DPPH自由基的清除能力见图8。

图8FPC对DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging effects of FPC on DPPH

由图8可以看出，随着总黄酮质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率迅速增强；当FPC为10.076mg/mL时，清除率为 50%，IC50=（10.076 ±1.03）mg/mL，显示出较高的体外清除DPPH自由基的的活性。

2.5 对羟自由基（·OH）的清除作用

H2O2和Fe2+混合后，可生成具有很高反应活性的·OH。在体系中加入水杨酸后，能有效的捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有强吸收。若加入具有清除·OH作用的物质，便会与水杨酸竞争，使有色产物生成量减少，FPC对·OH的清除作用见图9。

图9 FPC对羟自由基（·OH）的清除能力Fig.9 Scavenging effects of FPC on·OH

图9显示当FPC浓度为1.0 mg/mL时，对·OH的清除率为（24.473±0.124）%，随着FPC浓度的增加，其对·OH的清除能力增强，表明FPC对·OH的清除力与其浓度具有一定的量效关系。当FPC浓度为2.0 mg/mL时，清除率达50%，即IC50=4.605 mg/mL；FPC浓度为10.0mg/mL时，对羟自由基清除率达到（89.925±2.598）%，体现了FPC良好的清除·OH的活性作用。

3 结论

通过单因素与正交试验结果分析得出：对西红花花瓣粉末提取效果影响因素大小为：提取次数＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。FPC提取的最佳提取工艺为：乙醇浓度为60%，提取温度为70℃，提取时间为2 h，提取次数为3次。

抗氧化试验结果说明：对·OH和·DPPH具有较强的清除能力，抑制率分别为（89.925±2.598）%和（66.193±1.32）%，可能FPC清除·OH、·DPPH的物质基础或作用机理有所不同。上述试验结果提示FPC可能对生物机体具有保健功效，为其药物的开发提供理论依据。本试验采用工业废弃物为原材料，变废为宝，合理利用了西红花植物资源，具有较高的经济意义。

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[1]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴第16册[M].北京：科学出版社,1980:124

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京：化学工业出版社,2005:86

[3]Nair S C,Kurumboor S K,H asegawa J H.Saffron Cbemopre vention in Biology and Medicine[J].AReview.Cancer Biol herapy,1995,10(4):257-261

[4]Wang C J,Cheng T C.Inhibition of Protein kinase C and Protoncogene Expression of Croeetin in NÒ）I/3T3 cells[J].Mol Carcinogen,1996,17(4):235-240

[5]吴强,施诚仁,沈敏,等.藏红花浸出液通过CD95/CD95-L途径诱导神经母细胞瘤发生凋亡 [J].中华小儿外科杂志,2003,24(4):353-356

[6]周新春.藏红花治疗血瘀型冠心病心绞痛的研究[J].辽宁中医杂志,1997,24(6):283-284

[7]陈静,王灵台.西红花治疗慢性病毒性肝炎和肝硬化的疗效观察[J].中成药,1998,4(12):28-29

[8]张子良,孙迪安,陈福荣,等.西红花甙治疗高脂血症31例[J].中草药,1997,28(12):737

[9]高文远,朱大元.番红花的化学及药理研究概况[J].中草药,1999,30(5):389-391

[10]宋纯清,徐任生,黄哲天,等.西红花花被化学成分研究[J].中药材,1985(4):17-19

[11]Hossein Hosseinzadeh,Jafar Ghenaati Evaluation of the antitussive effect of stigma and petals of saffron（Crocus sativus）and its components,safranal and crocin in guinea pigs[J].Fitoterapia,2006,77(6):446-448

[12]Fatehi M,Rashidabady T,Zahra Fatehi-Hassanabad.Effects of Crocus sativus petals'extract on rat blood pressure and on responses induced by electrical field stimulation in the rat isolated vas deferens and guinea-pig ileum[J].Journal of ethnopharmacology,2003,84(2/3):199-203

[13]王强,杨竞雄.山柰中总黄酮的含量测定[J].现代应用药学,1990(2):9-13

[14]徐国兵,黄万著,王德群,等.百蕊草药材中山柰酚和总黄酮的含量测定[J].中医药学报,2008,36(1):39-41

[15]李姣娟,黄克瀛,龚建良,等.油茶叶乙醇提取物清除DPPH自由基作用的研究[J].林产化学与工业,2008,28(2):83-84

[16]朱晓宦,吴向阳,仰榴青,等.马齿苋粗多糖的提取及清除羟基自由基活性的能力[J].江苏大学学报:医学版,2007,17(1):58-59