高效分子排阻色谱法测定头孢米诺钠聚合物的含量

李 兵 肖甜甜

（吉林省食品药品检验所, 吉林 长春 132000）

高效分子排阻色谱法测定头孢米诺钠聚合物的含量

李 兵 肖甜甜

（吉林省食品药品检验所, 吉林 长春 132000）

目的 建立高效分子排阻色谱（HPSEC）法测定头孢米诺钠聚合物。方法 采用高效凝胶色谱柱（TSKgel G2500 PWXL 7.8mm ×300mm）；流动相为pH 7.0的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液（0.005mol/L的磷酸氢二钠：0.005mol/L的磷酸二氢钠（61∶39））；流速0.5mL/min；检测波长254nm；进样量为10μL；自身对照外标法定量。结果 头孢米诺钠的线性范围为2.02～40.36μg/mL（R=0.9999）；定量限为1ng；重复性（RSD）为1.3%（n=5）。样品测定的线性范围为0.4～2.5mg/mL（R=0.9995）。结论 该方法能够较好地分离头孢米诺钠和聚合物，简便快速，定量准确，重现性好，可用于头孢米诺钠中聚合物的检验。

头孢米诺钠；头孢米诺钠聚合物；高效分子排阻色谱法

2011年国家药品评价性抽验对目前市场上注射用头孢米诺钠的59家生产企业的219批样品进行了抽验，涉及的63个质量标准有60个缺乏聚合物测定项，且现有的聚合物测定项均采用葡聚糖凝胶G-10为填料的凝胶色谱法，在探索性研究实验中发现G-10凝胶色谱柱存在柱效低、分离效果差、且聚合物峰易被主峰包裹等缺点，本文参考相关文献[1-3]，采用近年来日趋成熟的高效分子排阻法建立了头孢米诺钠中聚合物的测定方法，经过方法学验证后对2011年国家评价性抽验的部分样品进行检验，并对检验结果进行了统计分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪。

1.2 试药

头孢米诺对照品（批号：130508-201003纯度：76.9% 来源于中检所）；供试品为2011年国家评价性抽验中16家生产企业的78批注射用头孢米诺钠（全部为头孢米诺原料药直接灌装，厂家与批号见表6）；乙腈为色谱纯。其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件和系统适用性试验

色谱柱：TSKgel G2500 PWXL（7.8mm×300mm）（TOSOH Japan）；流动相：pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液（0.005mol/L的磷酸氢二钠：0.005mol/L的磷酸二氢钠（61∶39）；流速0.5mL/min；检测波长254 nm；进样量为10μL。

2.2 对照溶液的制备

精密称取头孢米诺对照品约20mg置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5mL置50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液（10μg/ mL）。

2.3 测定法

精密称取供试品约25mg置25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，立即精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。另精密量取对照溶液10μL注入液相色谱仪，同法测定。将头孢米诺主峰前的杂质峰计为聚合物峰，按外标法以峰面积计算，含头孢米诺聚合物以头孢米诺计。供试品图谱见图1，聚合物保留时间为11.5min，与主峰有效分离。

图1 头孢米诺供试品

3 方法学考察

3.1 头孢米诺对照溶液线性范围

精密称取头孢米诺对照品13.12mg置250mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，为40μg/ mL的溶液，分别精密取5mL、2.5mL、2mL、7.5mL、1mL、2.5mL置10mL、10mL、10m、50mL、10mL、50mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液10μL注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。以头孢米诺对照品的浓度为横坐标（X），以头孢米诺峰面积为纵坐标（Y），求得回归方程：Y=20511X-2005.9（R=0.9999）。结果表明：头孢米诺浓度在2.02～40.36μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.2 头孢米诺与聚合物的线性关系

取注射用头孢米诺钠，精密称定。用流动相溶解并分别稀释制成每lmL中含头孢米诺0.4、0.8、1.0、1.2、1.8、2.5 mg的溶液，摇匀，按“2.1”项色谱条件，精密量取10μL立即进样分析，记录色谱图。以头孢米诺的浓度为横坐标（X），以聚合物的峰面积为纵坐标（Y），求得回归方程：Y=16957X+321.02，R=0.9995。结果表明：头孢米诺浓度在0.4～2.5mg/mL范围内与聚合物的峰面积呈良好的线性关系。

精密量取“3.1”项下头孢米诺对照品溶液（10.09μg/ mL）10μL，重复进样5次，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。RSD为0.6%，表明精密度良好。

3.3 定量限

精密称取头孢米诺对照品25.91mg置25mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL置100mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL置100mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以10倍信噪比计，最小定量限为0.8ng。

3.4 重复性

精密称取同一批次样品（海南卫康制药，批号20110101）约25mg置25mL量瓶中，称取5份，分别加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取头孢米诺对照品约20mg置100mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5mL置100mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算聚合物的含量。5次实验聚合物含量的RSD为1.3%，表明重复性良好。

3.5 供试品溶液稳定性

取注射用头孢米诺钠（广东白云山 批号：101062），按“2.3”项配制供试品溶液在室温25℃放置，分别在0、2、4、6、8、10、24h精密吸取10μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项的色谱条件测定聚合物的峰面积，计算百分含量。结果表明：供试品溶液随时间延长聚合物迅速增加，稳定性降低，在0、2、4、6、8、10、22小时聚合物分别为0.16%、0.39%、0.59%、0.81%、0.99%、1.11%、1.66%，因此在测定时供试品溶解后应立即进样。

图2 高聚物随时间的变化图谱

4 样品测定

照“2.3”项下方法测定16个厂家的78批次样品的聚合物。聚合物含量最低为0.08%，最高为0.73%，平均含量0.22%。不同厂家的样品聚合物的含量不同，相同厂家不同批次样品的聚合物含量不同，离散程度有很大差异。

5 讨 论

5.1 流动相种类

采用TSKgel G2500 PWXL色谱柱，分别采用pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液（0.005 mol/L的磷酸氢二钠：0.005 mol/L的磷酸二氢钠（61∶39））-乙腈（95∶5）与0.01 mol/L的醋酸铵（稀氨水调节pH 至7.0）-乙腈（90∶10）两种流动相测定同一份溶液的聚合物。两种流动相均能有效分离聚合物峰与头孢米诺主峰，而pH7.0的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液-乙腈（95∶5）对聚合物与主峰及主峰后面的杂质峰的分离效果更好，故选择pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液-乙腈（95∶5）作为流动相。

5.2 改变流动相比例

采用TSKgel G2500 PWXL色谱柱，分别采用pH 7.0的0.005 mol/ L的磷酸盐缓冲液-乙腈（90∶10）、pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液-乙腈（95∶5）、pH 7.0的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液三种比例的流动相测定样品中的聚合物。三种比例的流动相均能有效分离聚合物与头孢米诺主峰，使用TSKgel G2500 PWXL色谱柱测定聚合物对流动相比例的选择性较小，随着有机相比例不断减少，主峰后面的杂质峰分离度增加，而聚合物峰与主峰的分离度变化不明显。由于乙腈会对TSKgel G2500 PWXL色谱柱造成一定伤害，所以最好选择乙腈含量较小的流动相，最终确定pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相。

5.3 改变流动相离子强度

采用TSKgel G2500 PWXL色谱柱，分别采用pH 7.0的0.005 mol/ L的磷酸盐缓冲液、pH 7.0的0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液两种离子强度的流动相测定样品中聚合物的含量。两种离子强度的磷酸盐缓冲液均能使聚合物与头孢米诺主峰有效分离，其分离效果没有明显区别。最终选择盐浓度较低的pH 7.0的0.005 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相。

[1] 江晓玲.头抱菌素类抗生素中高分子杂质的研究进展[J].国外医药抗生素分册,2007,28(6):264.

[2] 王雅立,,高丹.头孢拉宗钠的聚合物检查方法的建立与验证[J].海峡药学,2010,22(7):70-72.

[3] 晏会根.高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量[J].海峡药学,2010,22(3):62-64.

R914

B

1671-8194（2013）21-0108-02