乙型肝炎病毒慢性感染与其表面抗原基因突变的相关性＊!

王卫华， 宋建新

华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉 430030

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染过程中存在病毒免疫逃逸，可能与其从免疫耐受到免疫激活状态过程中，T、B细胞抗原表位在面临免疫选择压力时发生改变，从而使其躲过免疫系统监视有关。在HBV感染自然史的不同时期中，乙肝表面抗原滴度存在显著差异［1－5］，这一现象可以推测，表面抗原在HBV感染中有重要意义，其基因突变可能在慢性HBV感染的发病机制和感染自然史中发挥着潜在作用。

1 材料与方法

1.1 血清样本及资料收集

收集2009年9月至2011年12月武汉同济医院收治的慢性乙肝患者280例。患者年龄范围18至70岁，其中男性175例，女性105例。入选要求：①HBsAg阳性病史大于半年。②排除甲肝、丙肝、丁肝、戊肝、艾滋病等病毒感染；排除自身免疫性肝病、淤血性肝病、酒精性肝病、代谢性肝病、药物性肝病引起的肝炎；排除脂肪肝；③HBV荧光定量＞1×103拷贝／mL；④从未接受核苷类似物及干扰素等抗病毒治疗。所有患者血清样本均于－80℃保存，用于后续的HBV基因组DNA荧光定量检测。

1.2 DNA提取及荧光定量

本实验采用上海复星长征医学科学有限公司生产的HBV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行检测。按照说明书处理样本及对照品，并配置试剂。随后进行荧光定量PCR扩增，50℃反应2 min，然后在94℃保温5min，接着按照93℃30s～60℃90s的程序循环40次。在60℃时设定荧光定量PCR仪收集FAM荧光通道的信号。最后进行质量监控，并按仪器及软件要求进行结果保存和数据分析。

1.3 HBV表面抗原基因克隆

根据欲扩增的HBV表面基因序列，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，进行巢式PCR扩增。根据S基因最保守的区域，我们设计一套外侧和内侧引物。外侧引物的上游序列为5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3′，下 游 序 列 为 5′-GGGGGTTGCGTCAGCAAACAC-3′；内侧引物上游 序 列 为 5′-ACTTTCCTGCTGGTGGCTCC-3′，下游序列为 5′-CCCAAAGACAAAAGAAAATTGG-3′。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收扩增产物，与pMD19-T Vector（大连宝生物工程有限公司）连接，构建T载体克隆，随后将连接产物转化已制备好的大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增。最后用B型小量质粒快速提取试剂盒抽提质粒。

1.4 DNA测序

以PCR产物作为模板DNA测序，使用ABI PRISM3730DNA自动分析仪，按操作规程进行HBV DNA上下游序列双向测定，测序结果用Chromas软件转化为FASTA格式，与GenBank上登记的HBV DNA标准序列比较。

1.5 突变位点及抗原表位分析

为了便于分析，本研究将乙肝表面抗原的突变重点放在表面抗原区，共研究了15个抗原表位，其中包含两类T细胞表位，即辅助性T细胞（Th）表位，包括 17-31 区域、37-51 区域、67-81 区 域、139-146区域、165-179区域和176-190区域；细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位，包括14-22区域、41-49区域、95-109区域、150-158区域、190-197区域和196－206区域。还有B细胞抗原表位，包括93-106区域、106-130区域和124-147区域。

1.6 统计分析

所有数据均使用SPSS 12.0软件进行统计分析。对两组或多组间的分类变量或者连续变量进行比较，分类资料采用卡方检验，连续变量采用Mann-Whitney检验和Kruskall-Wallis检验等非参数检验。研究对象的HBV DNA水平将数据转换为对数形式（lg）后进行分析。所有结果采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者临床资料

280例慢性HBV感染者基因型均为HBV B基因型或C基因型，未发现其他基因型。将处于HBV感染自然史各时期的患者分为：免疫耐受（IT）组（n＝76）、免疫清除（IC）组（n＝75），不活跃（IN）组（n＝66）和 HBeAg阴性肝炎（ENH）组（n＝63）。患者基本特征在表1中列出。患者中男性（65%）较多，乙肝病毒 B基因型毒株（76.4%）较多。在HBeAg阳性的两组中，处于免疫耐受期的患者年龄比免疫清除期的小，同时HBV DNA含量较高而ALT值较低。在HBeAg阴性的群体中，ENH组的病毒滴度以及ALT值均高于IN组。

表1 各组患者临床资料Table 1 Clinical data of the patients in different groups

2.2 Th抗原表位突变分析

各组HBV表面抗原Th抗原表位突变中，在4组间比较时具有统计学差异的是17-31、37-51、67-81等区域（P＜0.05），其余的 139-146、165-179、176-190等区域未发现显著性差异（P＞0.05），如表2所示。而进一步的两组之间的数据分析显示，这些差异主要来自HBeAg阳性的样本，即IT和IC组，以及HBeAg血清学转换前后的两组（IC和IN组）。在HBeAg阴性的两组中差异没有统计学意义。在17-31区域，最主要的突变发生在L21S，该突变在4组中的突变率分别为1.6%、10.0%、12.5%和16.0%。在37-51区域，IT 组发现1个G44E 突 变 （1.6%）；IC 组 发 现 了 N40S 突 变（5.0%），同时 44 位点（G44E，G44V）突变率达13.3%，47位点（T47K、V47E、T47A）突变率达到8.3%；IN组中N40S、G44E和47位点突变率分别为27.5%、17.5%和7.5%；ENH 组 N40S和 GEE4突变率分别为20.5%和6.8%。在67-81区域，IT组只发现I68T突变（1.6%），在IC组发现3个I68T突变（5.0%），IN组和ENH组I68T突变率分别为17.5%和11.4%。

2.3 CTL抗原表位突变分析

各组乙肝表面抗原CTL抗原表位突变中，在4组间比较时具有统计学差异的是14-22、41-49区域（P＜0.05），其余的95-109、150-158、190-197、196-206等区域未发现显著性差异（P＞0.05），如表2所示。进一步的分析同样显示差异主要来自于HBeAg阳性的样本，其他的几组样本间差异无统计学意义。在14-22区域，最主要的突变仍然是L21S，4组突变率分别为1.6%、11.8%、12.5%和15.9%。41-49区域的突变情况与Th抗原表位37-51区域的突变情况一致。

表2 乙肝表面抗原各免疫抗原表位的突变情况Table 2 Mutations of the immune antigen epitopes of the hepatitis B surface antigen

2.4 B细胞抗原表位突变分析

经过统计学分析，这4组患者的乙肝表面抗原B细胞抗原表位突变差异无统计学意义（P＞0.05）。4组中，均发现乙肝表面抗原免疫逃逸突变的存在。在IT组中发现T126S、Q129H、M133L；IC组中发现 Q101K、T126S、M133L、M133I和M133T；IN组中发现M133L和M133T；ENH组中发现T126S、M133L逃逸突变。

3 讨论

在早期的 HBV感染中，HBV准种（quasispecies）没有或者只受到很小程度的宿主免疫选择压力［6－7］。在十几岁的慢性乙型肝炎患者，机体会进入一个相对活跃的免疫病毒清除期以控制病毒复制［8］。以往对HBV慢性感染史的研究发现，病毒的突变体与疾病的进展相关［9］，包括核苷酸和结构的变化，如插入、缺失和删除。普遍认为对于病毒免疫逃逸的机制，其突变主要发生在MHC－Ⅰ细胞毒性T细胞表位内［10］，随着研究的深入人们发现HBV核心抗原中突变累积出现在MHC-Ⅱ辅助性细胞表位内［11］。除了核心蛋白，以前的研究也发现了在乙肝病毒S蛋白中HLA－Ⅰ类限制性抗原表位和“a”抗原决定簇内部的突变存在很高的变异率［12－14］。对于乙肝表面抗原的研究发现突变累积与MHC-Ⅰ类抗原表位相关，40和47位密码子的突变频率大约为83%［12］。然而，以往的研究往往集中于相对后期的感染，例如，在发展为肝硬化或肝癌（通常是40岁后），或在活动期肝炎或HBeAg血清转换后（通常围产期感染的大多发生在20岁后），或者是集中于相对前期的感染，即从免疫耐受期过渡到免疫清除期的阶段，而很少有文献报道在整个HBV感染自然史中表面抗原免疫逃逸突变分布情况。

在本项研究中，我们基于HBV感染自然史中4个时期来研究表面抗原内逃逸突变分布。按照HBV感染自然史将收集的病例分为4个时期，分别是免疫耐受期、免疫清除期、不活动期和HBeAg阴性肝炎阶段。研究乙肝表面抗原Th抗原表位突变，在4组间比较时发现具有统计学差异的是17-31、37-51、67-81 等区域 （P＜0.05），其余的 139-146、165-179、176-190等区域未发现显著性差异（P＞0.05）。而进一步的两两比较发现，这些差异主要来自于HBeAg阳性的样本，即IT和IC组，以及在HBeAg血清学转换前后的两组中（IC和IN）。HBeAg阴性的两组间没有差异。在各组乙肝表面抗原CTL抗原表位突变中，4组间比较时差异具有统计学意义的是14-22、41-49区域（P＜0.05），其余的95-109、150-158、190-197、196-206等区域未发现差异具有统计学意义（P＞0.05）。进一步的分析同样显示差异主要来自于HBeAg阳性的样本，其他的几组样本间差异无统计学意义。这显示了在HBV感染自然史中，表面抗原CTL、Th抗原表位内突变主要发生在免疫清除期阶段，在不活跃期和HBeAg阴性肝炎期并没有显著的增加，表明在免疫清除期的免疫压力对于乙肝表面抗原具有重要的意义。此外，在B细胞抗原表位区域，发现了Q101K、P120S、T126S、Q129H、M133L、M133I、和 M133T等7个乙肝表面抗原免疫逃逸突变，这些突变在B、C基因型中的分布频率，与全球提交的HBV序列预测的逃逸突变在各个基因型中的分布频率几乎完全一致，证明了HBV免疫逃逸突变在慢性乙肝中广泛存在。说明在HBV感染的各个时期均可能影响表面抗原检测，引起免疫球蛋白、疫苗保护失活的免疫逃逸突变的存在，这需要引起我们足够的重视。

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