去甲斑蝥素对裸鼠结肠癌移植瘤血管生成的影响及其机制!

袁昌劲， 余 涛△， 侯风刚， 李 丹， 刘 礼， 吕秀玮， 任 丽

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院中西医结合肿瘤科，武汉 430014

2上海中医药大学附属上海市中医医院肿瘤科，上海 200071

3武汉大学人民医院药学部，武汉 430060

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是我国自行研发的抗肿瘤药物，多年的临床运用已经证实该药具有抗癌活性强、靶点众多、毒副作用小的特点。至于其抗肿瘤机制，以往的研究对其细胞毒作用关注较多，后来发现NCTD还具有抗胆囊癌、乳腺癌血管生成的作用，其机制和NCTD诱导内皮细胞凋亡［1－3］，减少内皮细胞血管活性物质的释放，下调血管生成因子如血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促血管生成素2（angiopoietin-2，Ang-2）以及上调血管抑制因子如血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）、金属蛋白酶组织抑制因子2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP2）的表达有关［1，4］。随着临床应用的扩展，NCTD也用于消化道肿瘤包括肠癌的治疗，然而其对肠癌血管生成的影响至今未见报道。本课题组前期通过体外实验证实NCTD能够抑制内皮细胞迁移、粘附、管腔形成能力和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2；VEGFR-2）、内皮细胞钙粘蛋白（vascular endothelial cell cadherin，VE-Cd）的表达［5］。本文则从体内实验的角度观察NCTD对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤和瘤内微血管的影响。由于VEGF［6］、VE-Cd［7］、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2；MMP-2）［8］等促血管生成因子的表达在肿瘤血管生成过程中起着决定性作用，本实验拟通过观察NCTD对这些因子表达水平的影响，进而探讨NCTD抗结肠癌血管生成的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与动物

人结肠癌细胞株（HCT116）购自中国科学院上海细胞库；SPF级BALB／C裸鼠，雄性，体重15g，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司［生产许可证号为SCXK（沪）2003-002］，饲养于上海中医药大学附属普陀医院SPF级动物饲养间［许可证号为SYXK（沪）2005-2008］，自由摄食饮水。

1.2 药物、试剂与仪器

NCTD购自南京泽朗医药科技公司（纯度＞99%）；RPMI-1640培养液和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；兔抗VE-Cd单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗VEGF、MMP-2和CD34多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体购自R＆D公司。

1.3 细胞培养与动物造模

细胞用含10%胎牛血清、10万U／L青霉素和100mg／L链霉素的高糖DMEM 培养液，在5%CO2、37℃培养箱中培养，适时换液、传代，连续培养3代以上。造模取对数生长期的HCT116细胞，常规消化后制成密度为1×107／mL的细胞悬液，取0.5mL接种于裸鼠右前肢腋部皮下，当肿瘤长至直径约l cm时，在无菌条件下剥取瘤组织并切成l mm3的小块，用套管针接种至新一批共40只裸鼠右前肢腋部皮下。

1.4 动物分组及处理

裸鼠接种后采用随机数字表法将实验动物随机分成5组，分别为模型组，NCTD高、中、低剂量组和氟尿嘧啶组，每组均为8只。造模5d后开始给药：模型组予生理盐水0.5mL／只腹腔注射；NCTD实验组予 NCTD 8mg／kg（高剂量组）、5mg／kg（中剂量组）、2mg／kg（低剂量组）腹腔注射；氟尿嘧啶对照组予氟尿嘧啶20mg／kg腹腔注射，均每周2次，连续给药3周。给药结束后颈椎脱臼法处死荷瘤裸鼠，剥取瘤组织，称取瘤体质量，浸入甲醛固定，石蜡包埋。按以下公式计算抑瘤率（%）：抑瘤率（%）＝（模型组平均瘤质量－药物组平均瘤质量）／模型组平均瘤质量×100%。

1.5 微血管染色与判断

免疫组化两步法标记CD34，方法如下：将各组已包埋好的肿瘤组织切片，常规脱蜡，柠檬酸高温修复抗原，加3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗，滴加CD34兔抗多克隆抗体（1∶200稀释），4℃过夜，PBS洗，加二抗37℃孵育0.5h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，脱水封片。镜下可见CD34被染成黄褐色，标记出内皮细胞所在的位置，由内皮细胞形成管腔，且管腔小于8个红细胞面积，无较厚平滑肌包绕者即为微血管。每张片取5个热点区域并计数微血管，取5个视野的均值作为为微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.6 VEGF、VE-Cd、MMP-2免疫组化染色与检测

VEGF、VE-Cd、MMP-2染色采用SABC三步法操作。同1.5项二抗孵育完成后，PBS洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC（1∶100稀释），置于37℃温箱中0.5h，PBS洗后行DAB显色，苏木精复染，脱水封片。阳性表达位于细胞质中，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色，采用IMS细胞图像分析系统测定图像中的阳性染色面积和吸光度（A）值，计算免疫组化指数：（阳性面积×A值）／10 000，每张切片随机选取3个大小相等的视野，结果以3个视野的平均值表示。

1.7 统计分析方法

采用SPSS 15.0统计软件对实验数据进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠生长状态观察

整个实验过程中，氟尿嘧啶组小鼠出现消瘦、精神不振、动作迟缓、食量减少、便秘、皮肤光泽变差，皮温降低等情况。模型组1只裸鼠因灌胃操作不慎死亡，余基本未见不良反应；NCTD各剂量组基本未见不良反应。

2.2 NCTD对荷瘤裸鼠体重、瘤重、抑瘤率的影响

荷瘤裸鼠处死前带瘤称体重，各组裸鼠体重无明显差异，组间比较F＝1.027，P＝0.326。各组瘤重差异有统计学意义，组间比较F＝10.519，P＜0.01；两两比较结果可知，各用药组瘤重均小于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），以 NCTD（8 mg／kg）组和氟尿嘧啶组效果更为明显（P＜0.01）。各组抑瘤率见表1。

2.3 NCTD对瘤体MVD的影响

各组瘤组织CD34免疫组化染色热点区域如图1所示。按前文微血管的判定方法从图中可见，NCTD各剂量组中微血管数量明显减少。统计分析结果显示，随着NCTD剂量增大，微血管数量逐渐减少。各药物组MVD与模型组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组荷瘤裸鼠体重、瘤重及抑瘤率（±s）Table 1 The body weight，tumor weight and tumor inhibition rate of each group（±s）

表1 各组荷瘤裸鼠体重、瘤重及抑瘤率（±s）Table 1 The body weight，tumor weight and tumor inhibition rate of each group（±s）

与模型组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

组别 n 体重（g） 瘤重（g） 抑瘤率（%）7 25.52±3.13 1.61±0.45 －－NCTD（2mg／kg） 8 23.63±1.73 1.04±0.31＊ 36 NCTD（5mg／kg） 8 23.30±2.54 0.88±0.43＊ 46 NCTD（8mg／kg） 8 23.79±1.18 0.63±0.29＊＊ 61 5-FU（20mg／kg） 8 24.35±1.79 0.54±0.28＊＊模型组66

2.4 NCTD对瘤体VEGF、VE-Cd、MMP-2表达的影响

图2所示分别为 VEGF、VE-Cd、MMP-2免疫组化染色图片，模型组中均见到大量表达，而NCTD各组中表达量明显减少，以NCTD 8mg／kg组表达最少。软件测算的免疫组化指数见表2。各指标组间比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），各药物组与模型组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 NCTD对瘤体微血管密度的影响Fig.1 The effect of NCTD on the MVD of tumor tissues

图2 瘤体 VEGF，VE-Cd，MMP-2免疫组化检测（DAB，×40）Fig.2 Immunohistochemical staining of VEGF，VE-Cd and MMP-2（DAB，×40）

表2 NCTD对瘤体VEGF、VE-Cd、MMP-2表达的影响（±s）Table 2 The effects of NCTD on the expression of VEGF，VE-Cd and MMP-2（±s）

表2 NCTD对瘤体VEGF、VE-Cd、MMP-2表达的影响（±s）Table 2 The effects of NCTD on the expression of VEGF，VE-Cd and MMP-2（±s）

与模型组比较，＊P＜0.05

7 85.52±11.13 101.43±20.45 161.43±16.71 NCTD（2mg／kg） 8 63.63±17.83＊ 68.62±10.35＊ 65.36±12.31＊NCTD（5mg／kg） 8 42.30±12.54＊ 50.63±13.43＊ 59.76±10.34＊NCTD（8mg／kg） 8 15.79±10.18＊ 12.26±6.27＊ 20.63±10.29＊5-FU（20mg／kg） 8 20.35±9.79＊ 9.54±4.38＊ 15.42±9.26 VEGF VE-Cd MMP-2模型组组别 n＊

3 讨论

NCTD是从中药斑蝥体内提取活性成分经化学改造而成的新型抗肿瘤药物，其抗肿瘤靶点众多，作用机制复杂，能够通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抑制侵袭转移和调节免疫等多条途径抑制肿瘤的生长。在对NCTD最初的研究中，多是从这些角度出发，在临床和实验中观察到它能够抑制肺［9］、肝［10－11］、胃［12］、乳腺［13］等多种肿瘤细胞的增殖。本实验利用人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型观察到相同的结果，即NCTD可以在不影响荷瘤裸鼠生长状态的前提下抑制结肠癌移植瘤的生长。由于肿瘤的生长和转移必须依赖血管生成［14］，所以推测这种抑瘤效果并非单纯因为NCTD能够抑制瘤细胞的增殖或者诱导其凋亡，还可能与其抑制瘤体内血管生成有关。前期已有学者采用裸鼠移植瘤模型观察到NCTD可以抑制胆囊癌［1］、乳腺癌［15］的血管生成。本研究采用免疫组化方法标记CD34来间接反映各组结肠癌移植瘤内的MVD，发现NCTD各剂量组作用后瘤体内MVD明显减少，可见NCTD也可以抑制结肠癌移植瘤血管的生成，这些证据都有力支撑了从抗血管生成这个角度来研究NCTD的抗肿瘤机制。

研究证实［16］，肿瘤血管生成是以内皮细胞为主要角色，多因子参与的复杂过程。已有实验发现NCTD对内皮细胞的增殖存在抑制［2］，本课题组在前期体外实验中观察到NCTD能抑制内皮细胞的迁移、粘附、管状形成能力［5］。此外，NCTD还能影响血管相关生成因子如血管内皮生长因子、蛋白水解酶（主要是基质金属蛋白酶类，MMPs）、粘附分子的表达。VEGF是目前所发现的作用最强、特异性最高的促血管生成因子，它可以维持内皮细胞的活性，诱导内皮细胞增殖和迁移，募集骨髓源性造血祖或干细胞诱导血管形成［17］。VE-Cd是由内皮细胞特异性表达的一种跨膜粘附分子，胞外部分彼此连接，胞内部分和细胞骨架蛋白连接，控制着内皮细胞之间连接的稳定性，并负责向细胞内传导信号和促进血管的成熟，下调VE-Cd的表达将延缓血管样通道的形成［18］。MMP-2是明胶酶的一种，和肿瘤血管生成关系密切，其促进肿瘤血管生成的作用主要体现在两方面：一是降解局部ECM，为内皮细胞生长腾出空间；二是活化VEGF和另外一种血管生成的关键分子碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）［19－20］。本研究利用免疫组化方法检测了结肠癌移植瘤内VEGF、VE-Cd、MMP-2等3种促血管生成因子的表达水平，结果显示NCTD可以降低3种蛋白的表达，作用随剂量增大而增强。

综合以上结果和分析可知，NCTD不仅对抗了内皮细胞相关血管生成的行为，同时抑制促血管生成因子的表达，从内皮细胞途径起到抑制结肠癌血管生成的作用。那么，可以认为NCTD抑制结肠癌生长的机制不仅是抑制结肠癌细胞的增殖，而且与抗血管生成也有关系，并且其抗血管生成的作用主要通过内皮细胞途径来实现的。这在一定程度上充实了NCTD抗肿瘤的作用机制，为拓展NCTD临床用途开辟了新思路。至于NCTD抗肿瘤是否还涉及其他途径或者靶点，则有待于更深入的研究。

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