慢病毒介导Vimentin基因沉默抑制胰腺癌细胞侵袭和粘附的机制＊

李 旭， 江建新， 王 敏， 朱 峰， 田 锐， 申 铭， 秦仁义△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科，武汉 430030

2贵阳医学院附属医院肝胆外科，贵阳 550001

胰腺癌是死亡率最高且预后最差的恶性肿瘤之一。在我国，胰腺癌在恶性肿瘤导致死亡的原因中排第6位，其5年生存率不到3%［1］。大多数患者在确诊时已属晚期，且多伴有周围脏器的转移，从而丧失手术机会，这也是导致其治疗失败的主要原因［2］。波形蛋白（Vimentin）是中间丝蛋白家族的一个主要成分，在正常间质细胞中广泛表达，在维持和调节细胞功能中起重要作用。近年来，Vimentin被认为是上皮间质转化（EMT）特异性的标志物，在各种上皮癌，包括前列腺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、胰腺癌中高表达，且表达与肿瘤的生长和侵袭转移等密切相关［3］。有研究显示，下调Vimentin后能显著抑制肿瘤细胞的侵袭和转移［4］，但其具体的作用机制及在胰腺癌中的作用仍然不是十分清楚。本实验在前期作者成功构建以Vimentin为靶点的shRNA慢病毒载体的基础上，通过慢病毒介导的RNA干扰技术抑制胰腺癌细胞中Vimentin的表达，并探讨其对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 人胰腺癌细胞系Panc-1由本实验室保存；慢病毒干扰载体 Lv-VIM-GFP-shRNA由本实验室前期构建［5］。

1.1.2 试剂与仪器 细胞培养液DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）和胎牛血清均购自Gibco公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒（ReverTra Ace®qPCR RT kit，FSQ-101）、荧光实时定量PCR试剂盒（SYBR®Green Realtime PCR Master Mix，QPK-201）均购自日本TOYOBO公司；鼠抗人Vimentin单抗购自Sigma公司；兔抗人Integrinβ1和FAK多抗、鼠抗人GAPDH单抗购自美国ProteinTech Group公司；兔抗人E-cadherin、p-FAK多抗购自美国 CST（Cell Signaling Technology）公司；兔抗人 N-cadherin多抗购自Santa Cruz公司；F-actin特异性染料FITC-鬼笔环肽（FITC-Phalloidin）购自 Molecular Probes公司；所有二抗均购自武汉谷歌生物有限公司；Transwell小室购自Corning公司；Matrigel胶和纤连蛋白 FN 购自 BD 公司；poly-L-lysine、CollagenⅠ、CollagenⅣ均购自Sigma公司；引物序列由大连宝生物公司合成，由Primer.5.0软件设计。其余试剂均为国产分析纯试剂。荧光显微镜（奥林巴斯公司），Real-time PCR 仪（Applied Biosystems7300），Western blot系统（美国Bio-Rad公司），培养箱（美国thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染 将Panc-1细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液、5%CO2、37℃温箱中培养。细胞以1×105／孔接种在6孔板中，当细胞融合度达到约30%时，按病毒转染说明书进行转染，简述如下：转染前1d细胞更换无抗生素DMEM培养液，转染时按MOI＝5加入含有Polybrene（8μg／mL）的DMEM 培养液，转染12h后更换为完全培养液，并于转染72h后收集细胞，抽提RNA 及 蛋 白 分 别 进 行 Real-time PCR、Western blot检测，进而判断靶点的干扰效果及相关基因和靶蛋白检测。细胞转染分为3组：空白对照组（CON），未转染慢病毒的细胞；阴性对照组（NC），对照慢病毒Lv-NC-GFP-shRNA转染的细胞；基因敲除组（shVIM），被RNA干扰靶点病毒Lv-VIMGFP-shRNA转染的细胞。

1.2.2 Real-time PCR检测 收集上述3组细胞，用PBS洗3次，按Trizol说明书提取其总RNA。分光光度计（Eppendorf BioPhotometer，德国）测出总RNA的纯度和浓度。将RNA逆转录成cDNA：25μL反应体系中加入提取的RNA 2μg，按cDNA第一链合成逆转录试剂盒ReverTra Ace®qPCR RT kit说明书二步法合成cDNA。实时荧光定量PCR检测：按SYBR®Green Real-time PCR Master Mix说明书，在预热的ABI 7300荧光定量PCR仪上进行检测。预变性95℃3min，变性95℃15s，退火延伸60℃1min，在60℃读取数据；共40次循环。Vimentin 上 游 引 物 序 列 为 5′-AATGGCTCGTCACCTTCG-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CTAGTTTCAACCGTCTTAATCAG-3′；MMP-1上游引物序列5′-TCCGGTTTTTCAAAGGGAATA-3′，下游引物序列5′-CCTCAGAAAGAGCAGCATCGA-3′；TIMP-2上游引物序列5′-CCCCTCCTCGGCAGTGT-3′，下 游 引 物 序 列 5′-CCCCCTCGGCCTTTCC-3′；MMP-2 上 游 引 物 序 列 5′－CAAGGAGTACAACAGCTGCACTGA-3′，下游引物 序 列 5′-GGTGCAGCTCTCTCATATTTGTTGC-3′；MMP-9上游引物序列5′-CCAACTACGACACCGACGAC-3′，下 游 引 物 序 列 5′-GAAGGGGAAGACGCACAG-3′；GAPDH 上游引物序列为5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，下 游 引 物序 列 为 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。每 个样本目的基因的循环阈值与内参基因（GAPDH）的循环阈值的差异为ΔCt，实验样本与对照样本ΔCt的差异为ΔΔCt。以2－ΔΔCt表示基因的相对表达量。以上实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测 转染72h后，收集上述3组细胞，加入RIPA（碧云天，江苏）裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育30min，4℃12 000g，离心30min。将上清移至一新的EP管中，BCA法测定蛋白浓度。以50μg蛋白／泳道上样，10%～12%的SDS-PAGE电泳分离，电泳结束后将PAGE胶上蛋白用Bio-Rad电转移系统于4℃、300mA电转移1～1.5h至PVDF膜；加入5%的脱脂奶粉室温下封闭2h，将鼠抗人Vimentin一抗（1∶1 000）、鼠抗人GAPDH 一抗（1∶10 000）、兔抗人Integrin β1、E-cadherin、FAK、p-FAK、N-cadherin一抗（1 ∶200～2 000）以含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释后加入，分别置塑料薄膜中4℃孵育过夜。以HRP标记的羊抗鼠和抗兔IgG二抗（1∶2 000）37℃孵育1h；采用Pierce化学发光试剂盒进行显色。结果扫描后，经图像分析软件Quantity One进行灰度分析；以目的蛋白／内参照蛋白（GAPDH）的相对表达量进行半定量分析。以上实验重复3次。

1.2.4 体外Transwell侵袭和迁移实验 体外侵袭实验在每个Transwell小室的多聚碳酸酯膜（孔径为8μm）上铺人工基底膜胶（Matrigel），制成人工基底膜。取转染后72h的各组细胞无血清饥饿24 h后消化，用含0.1%BSA的无血清培养液调成密度为1×105个／mL的细胞悬液，每孔各取200μL加入上室，下室加入含20%胎牛血清的DMEM细胞培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h，取膜，拭去上表面未穿膜的细胞，下表面按Transwell说明书固定、结晶紫染色，200倍光镜下随机选择5个视野计数，取平均值。体外迁移实验除在Transwell上室不加铺人工基底膜胶（Matrigel）外，余下步骤同体外侵袭实验。

1.2.5 细胞划痕实验 取转染后72h的各组细胞消化，以细胞密度为5×105个／mL铺于24孔板（每孔500μL）上，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养16～24h，使形成单层细胞。用10μL移液枪枪头在单层细胞上划“一”字划痕，PBS清洗3次后加入无血清的DMEM孵育16h。吸去培养液，用PBS洗3次后在显微镜下观察并拍照。

1.2.6 细胞粘附实验 分别将 BSA、poly-L-lysine、CollagenⅠ、CollagenⅣ和FN溶液配制成10 μg／mL（1×PBS配制），每孔50μL铺于96孔板，置37℃1h。将经转染后72h的各组细胞消化，重悬于含0.1%BSA的DMEM培养液中，调整细胞密度为2×105个／mL，每孔加100μL细胞悬液，每组设3个平行复孔。于37℃、5%CO2的培养箱中孵育30min，吸去培养液中未贴壁细胞。4%多聚甲醛固定10min，0.1%结晶紫染色30min，PBS洗2遍后加入100μL含0.5%Triton X-100的裂解液裂解细胞，室温孵育过夜。用ELX800型酶标仪在595nm波长处测量A值。实验重复3次。粘附率（%）＝粘附细胞A595nm／总细胞A595nm×100%。

1.2.7 免疫荧光检测 备带有灭菌盖玻片的6孔培养板，每孔接种3×105个细胞于2mL培养液中。24h后取盖玻片做如下处理：4%多聚甲醛固定20 min，PBS液洗2次，加入0.1%Triton X-100室温下通透10min，再用PBS轻洗2遍，0.2%BSA室温封闭30min，Vimentin及FAK一抗均按1∶100稀释，4℃过夜后分别加入FITC和Cy-3标记的二抗孵育；FITC-鬼笔环肽（FITC-Phalloidin）5μg／mL（PBS稀释）室温下染色30min，PBS清洗2遍后加入1μg／mL DAPI（Sigma公司），染色5min，取出盖玻片上机观察。上述操作均需避光。

1.3 统计学分析

所有计量数据以±s表示，采用SPSS 15.0软件作统计处理，两样本均数比较采用成组设计资料t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染效率

细胞转染后72h，在荧光显微镜下可见明显绿色荧光。选5个200倍视野计算呈绿色荧光的细胞数占视野中全部细胞的比例，即转染率。转染Lv-VIM-shRNA的shVIM组转染效率为（88.6±1.2）%，转染 Lv-NC-GFP-shRNA 的 NC 组 转 染 效 率 为（85.2±1.4）%（图1A）。

2.2 病毒转染后对Panc-1细胞中Vimentin mRNA和蛋白水平的抑制

细胞转染72h后Real-time PCR检测结果显示，shVIM组细胞Vimentin mRNA表达显著低于2个对照组（均P＜0.01），CON 组 Vimentin mRNA的相对表达量为1.00，NC组Vimentin mRNA的相对表达量为0.92，shVIM 组Vimentin mRNA的相对表达量为0.23（图1B）。Western blot法检测转染72h后各组细胞Vimentin蛋白的表达情况，与CON组比较，NC组未见明显Vimentin蛋白表达抑制，而shVIM组Vimentin蛋白表达抑制明显（P＜0.01）（图1C）。免疫荧光检测转染72h后，shVIM组Vimentin表达明显下调，而CON组和 NC组Vimrntin表达则较强（图1D）。

图1 慢病毒介导Vimentin沉默效果Fig.1 Silencing efficacy of Vimentin by Lv-VIM-shRNA

2.3 抑制Vimentin对Panc-1细胞侵袭和迁移能力的影响

迁移实验结果显示，CON组和NC组穿膜细胞数分别为（415.5±8.6）和（362.3±6.6），而shVIM组穿膜细胞数为（165.0±5.6），低于两对照组（均P＜0.01），说明细胞体外运动能力明显降低；侵袭实验结果显示，CON组和NC组穿膜细胞数分别为（326.3±7.8）和（292.5±7.6），而shVIM 组穿膜细胞数为（125.8±5.2）（均P＜0.01），说明抑制 Vimentin后，Panc-1细胞的体外侵袭和迁移能力显著被抑制（图2）。

图2 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力（×100）Fig.2 Cell invasion and migration detected by Transwell chamber assay（×100）

2.4 抑制Vimentin对Panc-1细胞运动能力的影响

划痕实验结果显示，16h后CON组和NC组划痕间距与0h间距比值分别为39.6%和38.2%，而sh－VIM组为79.8%（P＜0.05），说明下调 Vimentin后可显著抑制胰腺癌细胞Panc-1的运动能力（图3）。

2.5 抑制Vimentin对Panc-1细胞粘附能力的影响

粘附实验显示，下调Vimentin后能够抑制Panc-1细胞对CollagenⅣ和FN的粘附能力（均P＜0.05），但对poly-L-lysine、CollagenⅠ的粘附能力无明显影响（均P＞0.05）。CON、NC、shVIM 组细胞对 CollagenⅣ的粘附率分别为（56.2±0.6）%、（55.4±0.6）%、（33.6±0.5）%，对FN 的粘附率分 别为 （28.6±0.5）%、（29.2±0.6）%、（13.6±0.4）%（图4）。

图3 划痕实验检测细胞运动能力（×40）Fig.3 Cell migration detected by scratch-wound assay（×40）

图4 粘附实验检测细胞粘附能力（×400）Fig.4 Evaluation of adhesion ability by cell adhesion assay（×400）

2.6 抑制Vimentin对Panc-1细胞肿瘤侵袭和粘附相关因子表达的影响

细胞转染72h后 Real-time PCR 检测显示，CON、NC、shVIM 组细胞在 MMP-1、MMP-2、TIMP-2和MMP-9的mRNA表达水平上无明显差异（均P＞0.05）（图5A）。同时 Western blot检测进一步验证3组细胞在粘附相关蛋白Integrinβ1、p-FAK／FAK以及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达上也无明显差异（均P＞0.05）（图5B）。

2.7 抑制Vimentin对Panc-1细胞骨架F-actin及黏附斑激酶FAK表达的影响

免疫荧光染色观察发现，相对于NC组，shVIM组的F-actin表达明显下调，并且其聚集减少，结构出现解体；同时黏着斑激酶FAK也发生重排，点状聚合排列减少（图6）。

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因。有学者提出肿瘤的侵袭过程可分为粘附、降解基底膜和基质运动“三步曲”。上述三个过程的进展，使得肿瘤细胞能够向周围组织不断侵袭转移［6］。早期研究发现细胞骨架与细胞的运动行为密切相关，中间丝是细胞骨架的主要成分之一，而Vimentin是表达最广泛的哺乳动物中间丝蛋白，其主要在正常间质细胞中表达。但近年来研究发现，Vimentin在上皮来源肿瘤细胞中也呈阳性表达，并被认为是肿瘤细胞发生上皮间质转化（EMT）的特征性标志物，且其表达量与肿瘤的侵袭能力呈正相关［3］。同时，国内外研究已证实在胰腺癌中也存在Vimentin的异常表达，并且其高表达可成为预测胰腺癌术后患者生存期的独立因素［7－8］。因此可以推测，Vimentin在胰腺肿瘤生物学，特别是侵袭转移特性中可能起重要作用。

Singh等［9］比较发现高侵袭性前列腺癌细胞LNCaP中Vimentin的含量是低侵袭性癌细胞CL1含量的20倍，而下调LNCaP细胞中Vimentin后能抑制其侵袭转移能力。Hendrix等［10］用小鼠VIM基因克隆载体稳定转染乳腺癌MCF-7细胞后，发现细胞的移动、侵袭力及成瘤性均增强。Paccione和McInroy等［11－12］也发现下调 Vimentin后能抑制肿瘤的侵袭和生长，并增加其上皮性标志物角蛋白的表达。魏军成等［13］将VIM过表达重组质粒导入激素非依赖性前列腺癌细胞后也发现其能促进细胞的侵袭和转移，并且这种作用可能是通过C-src激酶调节E－钙黏蛋白（E-cadherin）／β－连环蛋白（β-catenin）复合物而实现的。

图5 Real-time PCR和 Western blot分别检测 MMPs基因及EMT、粘附相关蛋白的表达Fig.5 The expression of MMPs，EMT-factors and tumor adhesion-related factors detected by real-time PCR and Western blot

图6 免疫荧光显示细胞骨架F-actin及黏附斑激酶FAK（×400）Fig.6 The expression of F-actin and FAK detected by immunofluorescence staining（×400）

尽管以上研究均证实Vimentin与肿瘤侵袭特性相关，但其具体机制以及在胰腺癌中的作用仍然不清楚。为了明确Vimentin在胰腺癌中的生物学功能，我们成功构建了以Vimentin为靶点的shRNA慢病毒表达载体，并稳定转染高侵袭性人胰腺癌细胞系Panc-1。结果发现稳定下调Panc-1细胞的Vimentin后，细胞侵袭和运动能力均显著降低，并且Panc-1细胞与细胞外基质成分CollagenⅣ、FN的粘附能力也下降。但进一步检测基质金属蛋白酶家族（MMPs）mRNA水平却未发现明显差异；另外，由于Vimentin是上皮肿瘤发生EMT转化的特征性标志物，因此我们检测了下调Vimentin后其它EMT特征性指标，结果发现下调Vimentin后对E-cadherin和N-cadherin均无明显影响，说明Vimentin的表达对EMT其它特征性指标影响不大，这也与Mendez等［14］的研究结果类似。而细胞粘附特性与整合素（Integrin）家族及黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）关系密切［15－18］，因此我们也检测了Integrinβ1、p-FAK／FAK 等蛋白的表达。发现下调Vimentin后对其也无显著影响。以上结果提示Vimentin可能通过其他途径来调控肿瘤的运动和侵袭能力。有研究表明，肿瘤细胞转移浸润过程与细胞骨架结构的变化密切相关，细胞内F-actin小体的聚合、微丝束的破坏与肿瘤的高转移性明显相关［15］。考虑到Vimentin也是一种细胞骨架蛋白，我们进一步通过免疫荧光法检测了骨架蛋白F－actin及黏着斑激酶FAK的空间表达情况，发现下调Vimentin后F-actin聚集减少且结构出现解体；同时黏着斑激酶FAK也发生重排，向心性点状辐射减少。因此，上述实验结果表明下调Vimentin后能引起胰腺癌细胞侵袭转移及粘附能力降低，而这种作用可能是通过改变细胞骨架结构导致相关结构蛋白重排而实现的。

综上所述，Vimentin与胰腺癌之间关系密切，下调其表达可显著抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移能力。同时，进一步阐明其在胰腺癌中与细胞骨架分子间的相互作用机制，将有助于阐明肿瘤侵袭转移的复杂过程，并有望将其作为抗肿瘤转移治疗的新靶点。

［1］ Guo X，Cui Z.Current diagnosis and treatment of pancreatic cancer in China［J］.Pancreas，2005，31（1）：13-22.

［2］ Hidalgo M.Pancreatic cancer［J］.N Engl J Med，2010，362（17）：1605-1617.

［3］ Satelli A，Li S.Vimentin in cancer and its potential as a molecular target for cancer therapy［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68（18）：3033-3046.

［4］ Ivaska J，Pallari H M，Nevo J，et al.Novel functions of vimentin in cell adhesion，migration，and signaling［J］.Exp Cell Res，2007，313（10）：2050-2062.

［5］ Jiang J X，Shen M，Qin R Y，et al.Construction of a lentiviral vector for RNA interference of human VIM gene and its silencing effect in pancreatic cancer cells［J］.Chinese-German J Clin Oncol，2009，8（3）：145-149.

［6］ Liotta L A，Wewer U，Rao N C，et al.Biochemical mechanisms of tumor invasion and metastases［J］.Adv Exp Med Biol，1988，233：161-169.

［7］ 殷涛，王春友，熊炯忻，等.Vimentin在胰腺癌细胞中的表达及临床意义［J］.世界华人消化杂志，2007，15（36）：3822-3825.

［8］ Handra-Luca A，Hong S M，Walter K，et al.Tumour epithelial vimentin expression and outcome of pancreatic ductal adenocarcinomas［J］.Br J Cancer，2011，104（8）：1296-1302.

［9］ Singh S，Sadacharan S，Su S，et al.Overexpression of vimentin：role in the invasive phenotype in an androgen-independent model of prostate cancer［J］.Cancer Res，2003，63（9）：2306-2311.

［10］ Hendrix M J，Seftor E A，Seftor R E，et al.Experimental coexpression of vimentin and keratin intermediate filaments in human breast cancer cells results in phenotypic interconversion and increased invasive behavior［J］.Am J Patho，1997，150（2）：483-495.

［11］ Paccione R J，Miyazaki H，Patel V.Keratin down-regulation in vimentin-positive cancer cells is reversible by vimentin RNA interference，which inhibits growth and motility［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（9）：2894-2903.

［12］ McInroy L，Maatta A.Down-regulation of vimentin expression inhibits carcinoma cell migration andadhesion［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，360（1）：109-114.

［13］ 魏军成，张永涛，马丁，等 .波形蛋白促进激素非依赖性前列腺癌细胞侵袭与转移的机制探讨［J］.肿瘤，2007，27（11）：857-860.

［14］ Mendez M G，Kojima S I，Goldman R D，et a1.Vimentin induces changes in cell shape，motility，and adhesion during the epithelial to mesenchymal transition［J］.FASEB J，2010，24（6）：1838-1851.

［15］ Calderwood D A，Shattil S J，Ginsberg M H.Integrins and actin filaments：reciprocal regulation of cell adhesion and signaling［J］.J Biol Chem，2000，275（30）：22607-22610.

［16］ Ning L，Chen H，Kunnimalaiyaan M.Focal adhesion kinase，a downstream mediator of Raf-1signaling，suppresses cellular adhesion，migration，and neuroendocrine markers in BON carcinoid cells［J］.Mol Cancer Res，2010，8（5）：775-782.

［17］ 张金平，唐荣华，吴军，等.慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元黏着斑激酶表达siRNA的筛选［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（1）：1-4，8.

［18］ 饶玉梅，方勇，韩志强，等.BRMS1对卵巢癌细胞c13＊转移侵袭的影响及机制［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（2）：131-136.