IL-17在低氧诱导肺动脉高压过程中的作用＊!

王宏飞， 张安臣， 李飞飞， 刘 波， 李冬寒， 杜心灵

华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科，武汉 430022

肺动脉高压是以肺微小血管内皮细胞、平滑肌细胞增殖迁移，凋亡抵抗，逐步导致以肺血管管壁增厚及管腔闭塞为特征的肺血管重构性疾病［1－2］。此疾病病因复杂，至今尚未完全探明其发病机制，但炎症因子和炎症反应在肺血管重构中的重要作用已逐步形成共识［3－10］。

蛋白组学研究发现炎症因子IL-17在特发性肺动脉高压患者肺组织中有显著的高表达［11］，同时IL-17在体循环血管重构［12－14］和以低氧性肺动脉高压为首要病因的慢性阻塞性肺疾病（COPD）中同样发挥着重要作用［15－18］，因此，我们推测IL-17在低氧性肺动脉高压的发生发展中扮演着重要角色。

本实验重点研究低氧诱导肺动脉高压小鼠肺组织中IL-17基因转录和蛋白水平的变化，以期为低氧性肺动脉高压分子机制提供新的诠释。

1 材料与方法

1.1 材料

①动物及分组：雄性C57B6小鼠，60只，8周龄，体重18～20g，均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，随机分为3组：对照组（n＝20），低氧3周组（n＝20），低氧6周组（n＝20）。②主要设备：低氧氧舱、测氧仪（RSS-5100，上海雷磁仪器厂）、Powerlab生理记录仪（美国AD instruments公司）、Millar导管（SPR-835）。③主要试剂：小鼠β-actin单克隆抗体（sc-47778，Santa Cruz公司）、兔抗鼠IL-17单克隆抗体（ab79056，Abcam 公司）、TransStart SYBR Green qPCR SuperMix（Trans公司）。

1.2 动物模型建立

常压动物饲养仓内持续注入氮气和氧气，根据测氧仪调节二者流量及流速，使氧浓度稳定于（10.0±0.5）%。用硅胶和无水氯化钙吸收水分，用钠石灰吸收二氧化碳。实验动物入仓后每3天开放1次鼠笼，每次不超过30min，进行清扫、补充食物和水等。对照组动物除吸入空气外，余条件同低氧组。实验小鼠进入低氧饲养仓，持续低氧3周、6周后检测小鼠肺动脉压力，留取肺组织及心脏组织样本，右肺组织采用液氮保存，左肺组织以4%多聚甲醛固定。

1.3 检测指标

1.3.1 血流动力学指标 小鼠麻醉并经气管插管通气后，自胸骨上缘至下颌骨下方做颈部正中切口，充分暴露右侧颈外静脉，插入Millar导管，导管连接Powerlab多道生理记录仪，根据Powerlab显示的压力曲线波形的移形变化判断导管尖端进入右心室后记录压力数据。测定右心室收缩压（RVSP）、右心室舒张压（RVEDP）及右心室压力上升和下降最大速率（dP／dtmax；dP／dtmin）。以连续12个心动周期的平均值作为实验数据进行分析。

1.3.2 右心室肥厚指标 测压后立即取出心脏，冲净余血，沿房室环剪去心房，沿室间隔边缘分离右心室（RV）和左心室＋室间隔（LV＋S），滤纸吸干水分后即刻电子天平称重，计算两者比值。

1.3.3 RT-PCR检测IL-17mRNA表达 ①引物设计：IL-17 正 义 链 5′-ACTACCTCAACCGTTCCA-3′，反 义 链 5′-CTGCCTCTGAATCCACATT-3′，390bp；β-actin 正义链5′-CTGGCCGGGACCTGACAGACT-3′，反 义 链 5′-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，623bp。②肺组织匀浆总RNA的提取：取液氮冻存小鼠肺组织50mg立即放入装有500μL Trizol溶液的1.5mL PE管中，小型组织匀浆器快速在冰上破碎组织；常规使用氯仿－异丙醇提取 RNA。Nanodrop测定 RNA 浓度、A260／A280、A260／A230。本研究中A260／A280比值大于1.75时才考虑用于后续实验。③RT-PCR反应及琼脂糖凝胶电泳：取肺组织匀浆总RNA 1μL，利用Trans公司的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA第一链。反转录反应参数：37℃15min（反转录反应），85℃5s（反转录酶的失活反应）。将反转录产物cDNA浓度稀释10倍，取4μL稀释后cDNA按照TransStart SYBR Green qPCR SuperMix（Trans公司）说明书进行操作。反应条件：95℃、预变性2min，95℃、变性15s，60.5℃、退火10s，72℃、延伸45s，25个循环，72℃ 终延伸10min。扩增完成后，取10μL PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，Alpha Imager图像分析仪进行灰度扫描，读取各条带吸光度值。结果以IL-17／β-actin吸光度值之比进行半定量分析。

1.3.4 Western blot检测IL-17蛋白表达 取液氮冻存肺组织40mg，加入400μL裂解液，超声破碎，98℃煮沸10min，离心取上清，并将上清液稀释10倍（20μL加入180μL去离子水配置成200μL）备用。取12μL总蛋白进行常规12%SDS-PAGE电泳（恒压115V、电泳时间135min），随后将蛋白质电转至PVDF膜（恒流400mA、转膜时间75 min），TBST洗涤后加3%牛奶（脱脂奶粉）-TBST 37℃封闭1h，分别加入IL-17兔抗鼠多克隆抗体（1∶1 000稀释）和β-actin鼠单克隆抗体（1∶2 000稀释），4℃摇床过夜，TBST洗涤3次，每次10min。IL-17再加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶4 000稀释），β-actin再加入抗β-actin鼠单克隆抗体（1∶4 000稀释），室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次10 min，ECL发光试剂显影。IL-17蛋白相对含量用IL-17／β-actin灰度比值表示。

1.3.5 肺组织病理分析 4%多聚甲醛固定肺组织常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5μm厚度切片，苏木精－伊红（HE）染色，高倍显微镜下观察肺动脉病理改变。每只小鼠取3张切片，石蜡切片常规脱蜡，微波炉进行抗原修复，3%的过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加IL-17兔抗鼠多克隆抗体（1∶50稀释），4℃湿盒中孵育过夜。以SP法进行免疫组化染色，染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。二氨基联苯胺（DAB）显色液，Harris苏木精复染，脱水封片，显微镜下观察，阳性反应产物为棕黄色细颗粒状。

1.4 统计学处理

所有数据使用GraphPad Prism 5软件处理系统进行分析，数据均以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用成组t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低氧组右心室压力及右心肥厚指数的变化

肺血流动力学指标测定结果表明，低氧组小鼠右心室收缩压RVSP和右心肥厚指数RV／（LV＋S）均明显高于对照组（均P＜0.01），并随低氧时间的延长而呈逐渐增高的趋势。与低氧3周组相比，低氧6周组小鼠右心室收缩压及右心肥厚指数增高更明显，差异具有统计意义（P＜0.01）。 见图1。

图1 低氧条件下右心室收缩压及右心肥厚指数变化Fig.1 Changes of right ventricular systolic pressure and right ventricular hypertrophy index under hypoxic conditions

2.2 IL-17mRNA在肺动脉高压小鼠肺组织中的表达

低氧诱导下，IL-17基因mRNA表达在低氧3周已出现升高，6周更为明显，与对照组相比，其差异均具有统计学意义（均P＜0.01）。与低氧3周组比较，低氧6周组IL-17基因mRNA表达增加更为明显（P＜0.01）。见图2。

图2 RT-PCR检测低氧条件下肺组织IL-17mRNA的表达变化Fig.2 RT-PCR analysis of expression of IL-17mRNA under hypoxic conditions

2.3 IL-17蛋白在肺动脉高压小鼠肺组织中的表达

Western blot检测结果显示，低氧诱导下，肺组织IL-17蛋白表达量明显升高，与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与低氧3周组比较，低氧6周组肺组织IL-17蛋白表达量升高更为明显，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 Western blot检测低氧条件下肺组织IL-17蛋白的表达Fig.3 Western blot analysis of expression of IL-17protein under hypoxic conditions

2.4 低氧条件下肺血管病理学改变及IL-17蛋白在肺组织中定位表达

由图4、5可见，低氧3周组小鼠肺动脉表现为内皮细胞轻度增生，胞核增大，胞体由扁平状转变为高柱状，平滑肌细胞亦表现为增生、肥厚，胞核增大，排列紊乱；第6周上述变化更加明显，平滑肌细胞增生较明显，排列紊乱，血管管腔变小，管腔不对称、狭窄，并出现非肌型小动脉严重肌化以至于管腔接近闭塞。免疫组化染色显示：低氧组肺动脉内皮细胞及肺泡上皮细胞可见黄染颗粒，且分布稠密，而对照组肺动脉内皮细胞及肺泡上皮细胞几乎没有黄染颗粒，差异显著；与低氧3周组相比，低氧6周组黄染颗粒分布更加密集，沿血管分布表现更为明显。

图4 低氧下不同时间点肺组织形态变化（苏木精－伊红染色，×400）Fig.4 Histological changes of lung tissues under hypoxic conditions（HE staining，×400）

图5 免疫组化染色显示肺组织IL-17表达变化（DAB，×400）Fig.5 IL-17expression changes of lung tissues by immunohistochemical method（DAB，×400）

3 讨论

肺动脉高压（PAH）是由多种病因导致的以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特点的一组病理生理综合征。目前认为，肺动脉高压的发生不能以单一的病理生理学理论来解释，而是涉及细胞、体液介质和分子遗传等多种因素。血管收缩和舒张因子、促进增殖和抑制增殖因子、促凝物质和抗凝物质等多种血管活性物质的失衡促进其发生。在这些因子作用下，肺动脉平滑肌细胞及内皮细胞过度增生，肺小动脉、毛细血管前动脉管壁增厚甚至闭塞，导致血管内腔变窄，血流阻力增加，导致肺血管重建，进一步形成肺动脉高压［1－2］。

IL-17是一种促炎症细胞因子，能诱导活化炎细胞产生多种促炎介质诱导炎症反应［19－21］，参与了机体多种炎症性疾病的发生、发展，与肿瘤、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、类风湿性关节炎等疾病关系密切［22－25］。Patel、Tsai等［12－13］研究证实IL-17可诱导超敏C反应蛋白（CRP）表达、调控CRP分泌，而CRP直接调节动脉粥样硬化斑块的炎症过程。Eid等［14］也证实，IL-17是通过联合IFN-γ共同作用于平滑肌细胞诱导炎性反应导致冠状动脉粥样硬化形成。动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，目前大多数学者支持“内皮损伤反应学说”，认为动脉粥样硬化是由于损伤动脉内膜引起，而动脉粥样硬化病变形成是动脉对内膜损伤作出的炎症－纤维增生性反应所致，这说明IL-17可调控内膜损伤及纤维增生性反应。

Barczyk等［15］研究表明慢性支气管炎、支气管哮喘患者急性发作期痰中IL-17表达增强，进而通过IL-17可能促进C-X-C趋化因子诱导中性粒细胞在呼吸道的募集，参与 COPD的发病过程［16］。Semik-Orzech等［17］研究发现COPD患者气道平滑肌增生程度、小气道增生程度与IL-17呈正相关，进一步研究发现IL-17增加胶原蛋白聚集，刺激成纤维细胞及平滑肌细胞增殖，从而在COPD发病过程中起重要作用。Shen等［18］发现用抗IL-17抗体处理香烟诱导COPD模型小鼠，炎性改变明显减轻，进一步证实IL-17可减轻COPD的发展。

这些研究表明IL-17可促进细胞增殖，还可产生内膜损伤及纤维增生性反应，同时可促进肺部炎症及纤维化的发生及发展，在COPD发病过程中起重要作用，对特发性肺动脉高压患者肺组织进行蛋白组化分析发现IL-17蛋白表达［11］，因此我们推测IL-17参与肺动脉高压发生发展过程。本研究结果提示，低氧3、6周小鼠右心室压力及RV／（LV＋S）均显著高于正常对照组，证明缺氧性肺动脉高压小鼠模型已成功建立。IL-17主要定位于内皮细胞上，肺泡上皮细胞也有表达。在低氧条件下，IL-17基因及蛋白表达水平也逐渐增加，与对照组相比，其差异具有统计学意义。

本研究提示，IL-17可能在低氧诱导肺动脉高压发生、发展过程中扮演了重要角色，因而推测阻断IL-17及其相关信号通路可能减轻、延缓甚至逆转肺动脉高压的发展，提高肺动脉高压的治疗效果。但在该病理进程中，IL-17的确切调节机制究竟如何，尚有待进一步的深入研究。

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