不同pH值L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎模型效果观察

石占利 浙江中医药大学附属中西医结合医院 杭州 310003

陈芝芸 高 凯 浙江中医药大学附属第一临床医学院

不同pH值L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎模型效果观察

石占利 浙江中医药大学附属中西医结合医院 杭州 310003

陈芝芸 高 凯 浙江中医药大学附属第一临床医学院

目的：观察不同pH值L-精氨酸腹腔注射诱导急性胰腺炎模型的效果。方法：70只BABL/ C小鼠，随机分为pH11组、pH8组和对照组，分别采用pH值为11的20%L-精氨酸溶液、pH值为8的20%L-精氨酸溶液、等体积生理盐水，间隔1h 2次小鼠腹腔内注射（250mg/100g体质量）的方法。在24h和48h分别观测三组小鼠的血清淀粉酶、胰腺病理学评分，并统计死亡率。结果：pH11组、pH8组小鼠在24h和48h的血清淀粉酶水平均较对照组显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；PH11组较pH8组24h和48h血清淀粉酶水平均升高更明显（P＜0.01）；pH8组24h和48h胰腺病理评分均较pH11组显著降低（P＜0.05），同时该组相应时间点的小鼠死亡率也较后者显著下降（P＜0.05）。结论：L-精氨酸溶液的pH值对胰腺损伤程度和动物的死亡率产生很大影响；精氨酸的强碱性对腹腔脏器的损伤是导致模型病变不稳定性的重要原因。

急性胰腺炎 小鼠 L-精氨酸

急性胰腺炎是临床常见的危重病，病情进展快，病死率高，动物模型是研究其病机、转归以及临床疗效的重要途径。多年来，应用精氨酸腹腔注射已经成为急性胰腺炎重要的造模方法，但国内外对精氨酸的应用剂量和造模效果存在着较大争议，笔者通过较系统的实验对该方法进行研究，进一步探讨该研究方法的干扰因素，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 BABL/C小鼠，雄性，体质量（20.82± 0.93）g，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：2008001619613。

1.2 试 剂 L-精氨酸（L-Arg）纯度≥98%，购自Sigma公司（货号A5006）应用生理盐水配制浓度为20%的L-精氨酸溶液；应用pH试纸测定配制溶液的pH值。

1.3 分组及实验方法 70只小鼠随机分为三组：pH11组30只：应用20%L-精氨酸溶液，pH值为11，按照250mg/100g体质量/次，间隔1h，共2次腹腔注射；pH8组20只：先将配制的20%L-精氨酸溶液应用盐酸调整pH为8，然后按照250mg/100g体质量/次，间隔1h，共两次腹腔注射；对照组20只：采用与pH8组相同体积的生理盐水，间隔1h，共2次腹腔注射。每组均观察24、48h两个时间点；其中pH11组在各时间点分别随机入选15只小鼠；其余组别各时间点均随机选入10只小鼠。

实验前各组小鼠禁食12h，不禁水；造模后各组均不禁水、禁食。

1.4 标本留置方法 在24、48h分别经摘除眼球取血并处死，留取胰腺组织。所采全血立即经低温自动平衡离心机离心（4 000rpm）10min，分离血清，-20℃保存；胰腺组织浸于10%甲醛溶液中固定24h，经过脱水、透明，石蜡包埋后制成石蜡切片并HE染色，请病理专业人员进行胰腺炎组织病理评价。

1.5 检测指标 24、48h小鼠的死亡率；血清淀粉酶；胰腺病理切片，每张切片观察10个视野，采用Schmidt J[1]等评分方法对胰腺病理进行评分，见表1。

表1 急性胰腺炎胰腺局部病理评分标准

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用方差分析、t检验，计数资料采用 χ2检验。

2 结果

2.1 小鼠血清淀粉酶变化 经过不同pH值L-精氨酸溶液腹腔注射后，小鼠24、48h的血清淀粉酶水平较对照组显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；24、48h时pH11组血清淀粉酶水平均较pH8组显著增高（P＜0.01）；pH8组48h的血清淀粉酶水平较24h显著增高（P＜0.01），而pH11组48h的血清淀粉酶水平与24h比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 三组血清淀粉酶水平比较（±s）U/L

表2 三组血清淀粉酶水平比较（±s）U/L

注：与同时间点对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与同时间点pH11组比较，▲▲P＜0.01；与同组24h比较，*P＜0.01

组别pH8组pH11组对照组n/只n/只971 0 24h 785.60±206.80△▲▲2667.33±843.76△△525.10±174.84 851 0 48h 1161.75±221.65△△▲▲* 2344.83±537.07△△517.60±113.35

2.2 胰腺组织病理变化

2.2.1 大体观察 对照组胰腺无明显病理改变；pH8组小鼠24、48h均未见腹水，也未见明显出血水肿，但可见胰腺充血，色泽变红；pH11组小鼠24h可见胰腺充血水肿，未见坏死病灶，腹腔轻微腹水，48h可见腹水量增多，胰腺水肿较前明显，肠系膜轻度水肿。

2.2.2 镜下观察 对照组24、48h均未见明显病变，胰腺组织结构清晰，细胞形态正常，无明显出血坏死和水肿等异常表现（见图1，2）；pH8组24h可见小叶间区域性水肿，48h时水肿较前明显，伴少量炎细胞浸润，但胰腺小叶结构完好，腺泡细胞无出血坏死等表现（见图3，4）；pH11组24h可见小叶内明显充血水肿，小叶间少量炎性细胞浸润，而48h则水肿进一步明显，出现少量腺泡细胞坏死，细胞核固缩，但未见出血性病变（见图5，6）。

2.2.3 病理评分 pH8组和PH11组两个时间点胰腺病理评分均较对照组（评分为0）显著升高（P＜0.05）；pH8和pH11组本组两个时间点评分比较差异无统计学意义（P=0.350，P=0.687），而在24、48h两个时间点，pH11组病理评分均较PH8组显著增高（P值分别为0.025和0.048），见表3。

表3 两组不同时间点胰腺组织病理评分比较（±s） 分

表3 两组不同时间点胰腺组织病理评分比较（±s） 分

注：与pH11组比较，▲P＜0.05

组别pH8组pH11组24h 1.11±0.60▲2.00±0.82 48h 1.38±0.52▲2.20±0.84

2.2.4 小鼠死亡率比较 对照组各时间点均无小鼠死亡；pH11组24、48h两个时间点的小鼠死亡率均显著高于pH8组（P＜0.05）；pH8组、pH11组24、48h本组两个时间点死亡率比较差异无统计学意义（P= 0.659）；见表4。

图1 对照组24h HE×200

图2 对照组48h HE×200

图3 pH8组24h HE×200

图4 pH8组48h HE×200

图5 pH11组24h HE×200

图6 pH11组48h HE×200

表4 两组不同时间点死亡率比较 只

3 讨 论

Mizinuma等[2]于1984年首次通过在大鼠腹腔内注射大剂量L-精氨酸（500mg/100g）创立了一种新的胰腺炎造模方法，此后这种方法被广泛的应用于急性胰腺炎病理过程的相关研究。但是该方法的造模效果同时受到药物浓度、用药剂量和用药间隔时间等诸多因素干扰，导致模型出现不稳定性，所以目前对该方法的具体操作仍存在较大争议。Tani等[3]研究发现单次腹腔注射大剂量L-精氨酸（500mg/100g）的大鼠在72h内可以导致70%～80%的胰腺组织出现坏死，但是大鼠在几小时内几乎全部死亡，所以注射方法之后也在不断改进。

目前对急性胰腺炎病机研究方面多项报道[4-5]采用了两次注射法，每次注射250mg/100g体质量，间隔1h。笔者前期研究发现，20%L-精氨酸未经pH调整，按照300mg/100g体质量和350mg/100g体质量进行腹腔注射后，BaBL/C小鼠24h死亡率在90%左右；而经过对L-精氨酸pH调整后，小鼠死亡率明显下降，并伴随胰腺损伤的减轻。为进一步探究试剂pH值对模型的影响，本次选择了250mg/100g体质量的L-精氨酸注射剂量进行研究。

关于L-精氨酸导致急性胰腺炎的病理机制目前尚不明确，目前研究主要涉及氧自由基、NO、NF-κB及炎症介质等引起的胰腺损伤[6-7]。但是，左旋精氨酸溶液PH值的影响不可忽视。我们经过配制后发现其溶液呈现强碱性，所以一些研究者为排除强碱引起的腹腔脏器损伤，包括胰腺损伤，在实验中调整了pH值，结果得出了不同的结论。Rajinder Dawra等[8]应用pH为7的8%L-精氨酸（盐酸矫正pH值）对C57BL/6小鼠进行了多次研究，结果发现采用2次注射法时只有注射剂量达到4g/kg×2时才能导致胰腺明显损伤，而小于该剂量（1、2或3g/kg体质量）时胰腺病理改变、血清淀粉酶及胰腺MPO活性和对照组（生理盐水）并无显著差异，这与本研究结果具有一致性，同时提示矫正pH值后造模所需L-精氨酸剂量明显增加。但是该研究使用的L-精氨酸浓度为8%，每10g体质量需要腹腔注射0.5mL，注射剂量较大，小鼠有可能出现容量负荷过重而死亡，遗憾的是该研究并未提及小鼠的死亡率；故此本研究采用了20%的L-精氨酸，并应用不同pH值进行进一步随机对照研究。

本研究证实，经过L-精氨酸pH调整后，胰腺仅出现极轻度的水肿和少量炎细胞浸润，模型的血清淀粉酶水平和病理评分均显著下降，同时死亡率也显著下降。pH11时小鼠24h死亡率53%（8/15），48h其死亡率达到了67%（10/15），而pH8时仅在10%～20%。由此再次证实L-精氨酸PH值是造成胰腺损伤的重要因素，也是导致模型不稳定性的重要原因。必须指出的是，L-精氨酸为pH8时，胰腺病理仅出现轻度的水肿，pH11时出现较明显水肿，但是均无出血及坏死等重症胰腺炎表现。此外，动物品系也是影响模型病理表现及死亡率的重要因素。有学者[9]应用雨蛙素对昆明白、ICR及BABL/C三种品系小鼠进行了研究，发现BABL/C小鼠更适用于急性胰腺炎模型的研究，其死亡率也相对较高。另有研究[10]采用腹腔注射L-精氨酸方法对C57BL/6和BABL/C两种品系小鼠进行了研究，发现两种品系急性胰腺炎时组织炎症因子表达存在显著差异，相同注射剂量下BABL/C炎症反应更重；C57BL/6模型小鼠24h死亡率为10%（2/20），显著低于BABL/C模型小鼠24h死亡率（40%，8/20，P＜0.05）。

综上所述，精氨酸诱导急性胰腺炎模型时，试剂pH值对胰腺损伤程度和动物的死亡率产生很大影响；精氨酸的强碱性对腹腔脏器的损伤是导致模型病变不稳定性的重要原因。所以我们认为，精氨酸诱导急性胰腺炎时必须校正pH值，借以排除强碱对腹腔脏器甚至腹腔外脏器导致的化学性损伤，同时加大精氨酸注射剂量，这样诱导出的模型才更符合急性胰腺炎的病理过程，尤其在研究急性胰腺炎继发其他脏器损伤过程时。

［1］Schmidt J，Lewandrowsik，Warshaw AL，et al.MorPhometric characteristicsand homogeneity ofanewmodelofacute Pan⁃creatitis in the rat［J］.Int JPancreatol，1992，12:41-51.

［2］Mizunuma T，Kawamura S，Kishino Y.Effectsof injecting ex⁃cessarginineon ratpancreas［J］.JNutr，1984，114:467-471.

［3］Tani S，Itoh H，Okabayashi Y，et al.New model of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive doses of argi⁃nine in rats［J］.Dig Dis Sci，1990，35:367-374.

［4］Czako L，Takacs T，Varga IS，etal.Involvementofoxygen-de⁃rived free radicals in L-arginine-induced acute pancreatitis［J］.Dig Dis Sci，1998，43:1770-1777.

［5］Alison SF.Elder Gino TP，Saccone Gino TP，et al.L-Argi⁃nine-induced acute pancreatitis results inmild lung inflam⁃mation without altered respiratory mechanics［J］.Experi⁃mental Lung Research February，2011，37：1-9.

［6］Péter Hegyi，Zoltán Rakonczay Jr，Réka Sári，et al.L-argi⁃nine-induced experimental pancreatitis［J］.World JGastro⁃enterol，2004，10（14）:2003-2009.

［7］Gy örgy Biczó，Péter Hegyi，Sándor Dósa，et al.The Crucial Role of Early Mitochondrial Injury in L-Lysine-Induced Acute Pancreatitis.Antioxidants&Redox Signaling［J］.No⁃vember，2011，15（10）:2669-2681.

［8］Rajinder Dawra，Rifat Sharif，Phoebe Phillips，etal.Develop⁃mentof a newmousemodel of acute pancreatitis induced by administration of L-arginine［J］.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292:G1009-G1018.

［9］仇小涛，王西墨，江涛.不同品系小鼠急性胰腺炎并发肺损伤模型的比较［J］.天津医药，2010，5，38（5）:418-420.

［10］吕金利，申海鹰，沈利群，等.不同品系小鼠急性胰腺炎预后差异及其机制探讨［J］.实用医药杂志，2006，9，23（9）:1074-1076.

Ef f e c t o f Ac u t e Pa n c r ea t i t i s Mo d e l In d u c e d b y Di f f e r en t p HVa l ue s o f L-a r g i n i ne

SHIZhan-li,CHENZhi-yun,GAOkai.The Affiliated Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Traditiona lChi⁃nese Medicine University,Hangzhou(310003),China

Objective:To investigate the effect of acute pancreatitis model induced by different pH values of L-arginine.Methods:Seventy BABL/C mice were randomly divided into 3 groups.Two groups were treated with L-arginine solution of pH 11 and pH 8,respectively.L-arginine solutions were intraperitoneally injected 250mg/ 100g body weight twice at an interval of 1 hour.Another group served as control and was treated with same vol⁃ume of saline.Serum amylase was determined and pancreas pathological score and mortality rate were calculated in all groups at the time of 24 and 48 hours after injection.Results:Compared with the control group,the se⁃rum amylase levels were significantly increased in the pH11 group and pH8 group at the time of 24 and 48 hours(P＜0.01).Compared with the pH11 group,the serum amylase levels in the pH8 group were significantly de⁃creased at the time of 24h and 48h(P＜0.01),meanwhile,the pancreas pathological score and mortality rate in the pH8 group were also decreased significantly at both time points(P＜0.05).Conclusion:The pH value of L-ar⁃ginine solution has a significant impact on the degree of pancreatic injury and animal mortality.The strong alka⁃line of L-arginine which does damage to abdominal organs is an important reason for instability of acute pancre⁃as model.

acute pancreatitis mice L-arginine

2012-10-22

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2011KYB075）