大青叶等清热药对HaCaT细胞增殖的影响

郑明警 浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310053

马丽俐 浙江省中医院

大青叶等清热药对HaCaT细胞增殖的影响

郑明警 浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310053

马丽俐 浙江省中医院

目的：观察单味清热类中药大青叶、水牛角、龙胆草、生地、黄芩提取物对HaCaT细胞增殖的影响。方法：用MTT法检测上述单味清热类中药提取物对HaCat细胞的24h抑制率。结果：大青叶、龙胆草、黄芩、生地提取物具有抑制HaCaT细胞增殖作用，且与药物浓度具有一定相关性；水牛角提取物具有促进HaCaT细胞增殖作用，且与药物浓度具有一定相关性，与空白对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:抑制角质形成细胞增殖可能是大青叶、生地、黄芩、龙胆草治疗银屑病的作用机制之一，水牛角治疗银屑病的作用与抑制角质形成细胞增殖无关。

银屑病 HaCaT细胞 清热类中药

银屑病是一种慢性复发性皮肤疾病。病理学表现为表皮角质形成细胞过度增殖[1-3]及异常分化，炎症细胞浸润，真皮血管增生。临床表现为红色斑块，覆有多层银白色的鳞屑。角质形成细胞功能改变在银屑病的发病中具有重要作用[3]。HaCaT细胞是成人皮肤中分离得到的一种永生化的角质形成细胞株，与正常人角质形成细胞增殖、分化特性相似，遗传特性稳定，现常用来替代人表皮角质形成细胞进行实验研究[4]。本实验旨在观察清热类中药大青叶、水牛角、龙胆草、生地、黄芩提取物对HaCaT的增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 HaCaT细胞由浙江省中医药大学附属第一医院中心实验室提供，大青叶、水牛角、龙胆草、生地、黄芩中药提取物购自浙江省中药研究所，1640培养液购自Hylcone，胎牛血清购自杭州四季青公司，0.25%含EDTA胰酶购自吉诺公司，rhEGF购自Sino Biological Inc。

1.2 HaCaT细胞培养 HaCaT细胞用含10%胎牛血清的1640培养液培养于37℃ CO2培养箱，定时换液、传代培养。

1.3 MTT法检测HaCaT细胞增殖 将处于对数生长期的HaCaT细胞以1×104/孔密度接种至96孔板，置于CO2培养箱内培养24h后，换含20ng/mL的rhEGF的培养液，继续培养24h，设空白对照组、大青叶、生地、龙胆草、生地、黄芩五个加药组，加药组换1640稀释药物配成的培养液，每一个浓度设5个复孔（统计结果时去掉最高和最低值）。24h后，每孔MTT（5mg/ mL）20μL，37℃培养箱培养4h后终止培养，2000rpm离心10min，弃去培养液，每孔加入DMSO150μL，置细胞板荡器振荡10min，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值（OD值）。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，采用方差分析。

表1 大青叶提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

表1 大青叶提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05

组别空白对照组大青叶提取物组n333333浓度/（mg/mL）081 6 24 32 40 OD值0.412±0.060 0.284±0.010△0.304±0.008△0.235±0.012△0.120±0.012△0.100±0.013△

表2 龙胆草提取物对HaCat细胞增殖的影响（±s）

表2 龙胆草提取物对HaCat细胞增殖的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05

组别空白对照组龙胆草提取物组n333333浓度/（mg/mL）0 10 20 30 40 50 OD值1.096±0.011 0.960±0.016△0.831±0.007△0.531±0.008△0.379±0.009△0.110±0.010△

表3 水牛角提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

表3 水牛角提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05

组别空白对照组水牛角提取物组n3333浓度/（mg/mL）0 70 80 90 OD值0.467±0.008 0.519±0.007△0.686±0.005△0.857±0.013△

表4 黄芩提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

表4 黄芩提取物对HaCaT细胞增殖的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.05

组别空白对照组黄芩提取物组n333333浓度/（mg/mL）0 50 60 70 80 90 OD值1.257±0.007 0.414±0.006△0.357±0.005△0.331±0.003△0.325±0.006△0.301±0.008△

2 实验结果

大青叶、龙胆草、黄芩、生地提取物对HaCaT细胞都有一定的抑制作用，且抑制率随药物浓度的增加而增加。水牛角提取物对HaCaT细胞具有一定促进生长作用，且在一定浓度范围内，随药物浓度增加，促进生长作用加强。见表1～5，图1～7。

表5 生地提取物对HaCaT细胞增殖的影响

图1 空白对照组细胞边境清楚，长势良好

图2 8mg/mL大青叶提取物作用24h后，大部分细胞仍保持正常的细胞形态，少量细胞明显变圆，呈空泡状。

图3 40mg/m L大青叶提取物作用24h后，大量细胞明显变圆，呈空泡状，贴壁不牢，或漂浮。

图4 40mg/mL龙胆草提取物作用24h后，大量细胞明显变圆，呈空泡状，贴壁不牢，或漂浮。

图5 90mg/mL水牛角提取物作用24h后，细胞边境清楚，长势良好，较空白对照组细胞更密集。

图6 90mg/mL黄芩提取物作用24h后，细胞边界模糊，贴壁不牢。

图7 90mg/mL生地提取物作用24h，部分细胞边界模糊。

3 讨论

银屑病中医称之为白疕，其进展期临床多为里热炽盛，临床上常用清热类中药对症治疗，疗效确切。马丽俐等[5]用清热凉血方治疗血热型银屑病31例，治疗后患者的PASI指数较治疗前明显降低（P＜0.01）。“白疕一号”、“消银解毒汤”、“克银一号”等诸多方剂均用到大青叶、水牛角、龙胆草、生地、黄芩等中药[6-8]。本实验选取的单味清热类中药均为里热证银屑病常用药物。

中药提取物作用于细胞已经是一种很普遍的实验方法[9-10]。研究表明，银屑病患者角质形成细胞VEGF表达明显高于健康人[11]，而EGF及其受体在银屑病的表皮过度增殖中起着关键作用，是引起该病重要的致病因子之一[12]。本实验用rhEGF刺激Ha⁃CaT细胞使其处于过度增殖状态，模拟银屑病患者角质形成细胞过度增殖的情况[13]。并通过MTT方法观察5种清热类中药对HaCaT细胞活性的影响。结果显示，大青叶、龙胆草、黄芩、生地黄提取物对HaCaT细胞增殖都有一定的抑制作用。说明大青叶、龙胆草、黄芩、生地能抑制HaCaT细胞的增殖，其作用强度与药物浓度和作用时间有关。抑制角质形成细胞的增殖可能是大青叶、龙胆草、黄芩、生地治疗银屑病的作用机制之一。但是水牛角对HaCaT细胞增殖无抑制作用，表明水牛角治疗银屑病的作用机制可能与大青叶、龙胆草等不同。抗炎、降低毛细血管通透性可能为水牛角治疗银屑病的作用机制之一[14-17]。

［1］宋静，王万卷.寻常型银屑病患者皮损及尿液中表皮生长因子检测的临床意义［J］.陕西医学杂志，2009，38（10）: 1418.

［2］李新宇，郑家润.银屑病发病机制的现代研究［J］.国外医学皮肤性病学分册，1998，24（3）:137.

［3］高春芳.角质形成细胞在银屑病发病机制中的研究进展［J］.国外医学皮肤性病学分册，2000，26（4）:216.

［4］朱崇涛，彭代智，周新，等.以HaCaT细胞为种子细胞构建新型人组织工程皮肤［J］.现代生物医学进展，2007，7（6）:817．

［5］马丽俐，骆丰，余土根，等.清热凉血方对血热型寻常型银屑病患者血清VEGF水平和PASI指数的影响［J］.中国中医药科技，2008，15（3）:168.

［6］北京中医医院.赵炳南临床经验集［M］.北京：人民卫生出版社，1975:211.

［7］金起凤.消银解毒汤治疗银屑病58例疗效观察［J］.辽宁中医杂志，1983，7（6）：29-30.

［8］中医研究广安门医院.朱仁康临床经验集［M］.北京：人民卫生出版社，1979:153.

［9］禹立霞，谢丽.6种中药提取物对胃癌细胞株细胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究［J］.医学研究生学报，医学研究生学报，2010，23，（9）:962.

［10］赵茉，高莉，彭晓明，等.黄连提取物对角质形成细胞增殖活性的影响［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（8）: 22．

［11］张宪旗，冯捷.银屑病患者角质形成细胞VEGF表达的研究［J］.中国皮肤性病学杂志，2004，18（4）:193.

［12］Krueger JG，Bowcock A.Psoriasis pathophysiology:current concepts of pathogenesis［J］.Ann Rheum Dis，2005，64（Suppl2）：30-36.

［13］青柳俊.表皮生长因子和银屑病的实验模型［J］.国外医学·皮肤病学分册，1988，4（30）:101.

［14］张少波.水牛角治疗银屑病［J］.辽宁中医学院学报，2006，8（1）：69.

［15］孙宝森.动物角类的药用研究概况［J］.中医药信息，2004，21（3）：25.

［16］Liu R，WangM，Duan JA.Antipyretic and antioxidantactiv⁃ities of the aqueous extract of Cornu bubali（water buffalo horn）［J］.Am JChin Med，2010，38（2）:293-306.

［17］曹雯，许道龙.复方水牛角提取物镇痛、抗炎作用的实验研究［J］.药学服务与研究，2011，11（2）:103.

Effect of Chinese Herbs w ith Properties of Clearing away Heat on the Proliferation of HaCaT Cells

ZHENG Ming-jing,MA Li-li.The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Uni⁃versity,Hangzhou(310053),China

Objective:To investigate the influence of folium,buffalo horn,gentian,habitat,and skullcap extracts on the proliferation of HaCaT cells.M ethods:The 24h inhibitory rate of HaCaT cell proliferation by the above mentioned Chinese herbs was examined by the MTT method.Results:Folium,gentian,skullcap,and habitat ex⁃tracts inhibited the proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner,while buffalo horn extract advanced the proliferation of the cells in a dose-dependent manner,and these results were all significantly different as compared to blank control groups(P＜0.05).Conclusion:One of the mechanisms by which folium,buffalo horn, gentian,and skullcap treat psoriasis may be inhibiting the proliferation of malpighian cells,while buffalo horn does not have the same effect when being used to treat psoriasis.

psoriasis HaCaT cells Chinese herbs with properties of clearing away heat

2012-11-05

浙江省自然科学基金项目（No.Y2091225）

马丽俐，Tel:13858022185，E-mail:Ma-lil@ihotmai.l.com