氯苄基砜衍生物含量测定方法学研究

陈莉?杨建云等

摘 要 目的 建立氯苄基砜衍生物（CBS）含量测定高效液相色谱法，并进行方法学研究，验证方法的可靠性及科学性；方法 色谱柱为Phenomenex LUNA C18 250×4.6mm 5μm；流动相为乙腈- 0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；流速1.0 mL.min-1；检测波长279 nm；柱温40 ℃；进样体积20 μL；结果 精密度RSD为0.6%，线性范围为10 μg·mL-1～100 μg·mL-1 （r2=0.9990），CBS平均含量为100.91%（n=6），有关物质与主峰分离良好。结论 该方法简便、灵敏、准确，可用于CBS的质量控制。

关键词 氯苄基砜衍生物 方法学研究 高效液相色谱法

辐射对正常人体细胞的损伤早在1896年就为公众所知，其对细胞和组织的作用是一个复杂的现象。近年来受各种因素影响，人们受辐射几率有所提高[1]，在一些特殊诊断、治疗过程中，不可避免地会受到不同程度的辐射[2]。氯苄基砜衍生物（CBS）为一种新型的具有DNA修复功能的化合物[3]。其已被证明，在受到辐射照射时可发挥保护作用[4]。然而，目前没有高效液相色谱法[5]可用于分析此化合物。本文旨在建立和验证，CBS的高效液相色谱分析；采用液相色谱分析在酸性，碱性及氧化条件下CBS的降解产物[6]；应用此方法，评估CBS固态药物稳定性，研究其质量控制方法。

1 仪器与试药

Waters Alliance 2996/2695高效液相色谱仪（美国）；BP211D型电子天平（德国SARTORIUS）；UV2510紫外可见分光光度计（日本岛津）。CBS对照品（批号20111103，纯度99.96%）CBS供试品（自制，批号：20110916，20110929，20111021）均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。乙腈（色谱纯）购自山东禹王实业有限公司；三氟乙酸（色谱纯），水为纯化水（哇哈哈有限公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18 （250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸（45：55，V/V）；检测波长：279 nm；流速：1.0 ml/min；进样体积：20 ?L；柱温：40 ℃。在该色谱条件下，理论板数按CBS峰计算不低于10000，分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 CBS色谱图（保留时间在11.9min，杂质峰21.3min）

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制 精密称取对照品10 mg于100 mL量瓶中，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL约含CBS0.1 mg的溶液，作为对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液配制 精密称取样品10 mg，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）溶解并制成每1 mL约含CBS0.05 mg的溶液，作为供试品溶液备用。

2.3 专属性考察

2.3.1 酸降解物 取CBS样品配制得1 mg/mL贮备液。精密量取贮备液1 mL于10 mL量瓶中，加1.0 mol.L-1盐酸3 mL，80 ℃水浴加热5.5小时，加1.0 mol.L-1氢氧化钠3 mL调至中性，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，进样20 ?L，记录色谱图2（a）。

2.3.2 碱降解物 取CBS样品配制得1 mg.mL-1贮备液。精密量取贮备液1 mL于10 ml量瓶中，加1.0 mol.L-1氢氧化钠3 mL，80℃水浴加热5.5小时，加1.0 mol.L-1盐酸3 mL调至中性，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，进样20 ?L，记录色谱图2（b）。

2.3.3 氧化产物 取CBS样品配制得1 mg.mL-1贮备液。精密量取贮备液1 mL于10 mL量瓶中，加30%双氧水3 mL，80℃水浴加热5.5小时，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）定容至刻度，进样20 ?L，记录色谱图2（c）。

2.3.4 光降解物 取CBS样品在4500 xl光照条件下放置10天后，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）配制得100 μg.mL-1溶液，进样20 ?L，记录色谱图2（d）。

2.4 线性范围的考察

分别精密量取“2.2项下”对照品贮备液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，置10 mL量瓶，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）稀释至刻度，分别配制成10、20、40、50、60、80 μg.mL-1的梯度对照品溶液，取上述溶液及贮备液20 μL，在“2.1”色谱条件项下分别2次进样。以对照品进样浓度（X，μg.mL-1）为横坐标，以对照品峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，结果表明CBS在10 μg.mL-1～100 μg.mL-1的范围内具有良好线性关系。回归方程为Y=10018X+54521，r2=0.9990（n=7）。

2.5 检测限与定量限的确定

以信噪比3：1时注入仪器的量为检测限，以信噪比约为10：1时注入仪器的量为定量限。结果CBS的检测限为1.2 ng，定量限为4.0 ng。

2.6 精密度试验

取“2.4”项下浓度为50 μg.mL-1的对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，其色谱峰面积的RSD为0.6%。结果表明测定时仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批的LF原料药按“2.2”项下方法制备浓度为40 μg.mL-1、50 μg.mL-1和60 μg.mL-1的高中低3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，在“2.1”色谱条件项下分别进样测定，平均含量为100.91%，RSD为0.93%，表明本法的重复性良好。

2.8 稳定性试验

取室温下放置的高、中、低3个浓度的供试品溶液，在0，4，8，12，24，48，72 h分别进样20 μL，测定峰面积，计算高、中、低3个浓度的峰面积的RSD分别为1.3%、1.5%及0.43%。表明供试品溶液在室温放置72h内稳定性良好。

2.9 有关物质

取样品10 mg，加不加酸流动相溶解并稀释制成每1 mL约含0.1 mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的方法试验，精密量取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使对照溶液中主成分峰的峰高约为记录仪满量程的10%-30%；再取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，用各有关物质峰面积与对照溶液主成分峰面积（1%）做比较，计算有关物质的量，单个杂质不得大于1.0%，总杂质不得高于1.5%，结果见表1。

3 含量测定

精密量取供试品储备液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）稀释至刻度，摇匀，得到50 μg.mL-1的样品溶液。精密量取20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。另取对照品储备液5 mL置10 mL量瓶中，加不加酸流动相（乙腈：水=45：55）稀释至刻度，摇匀，得到50 μg.mL-1的对照品溶液，依“2.1项下”色谱条件测定。按外标法以峰面积计算其含量，结果见表1。

4 讨论

4.1 波长选择

采用全波长对样品进行测定，通过考察各成分的分离情况及各色谱峰的丰度，最后选定检测波长为279 nm。

4.2 流动相确定

比较3种流动相系统及其不同的流动相比例，包括乙腈：0.1%三氟乙酸、甲醇：0.1%三氟乙酸、乙腈：醋酸水溶液，比较的醋酸浓度有0.1%，0.05%醋酸水溶液；乙腈：0.1%三氟乙酸系统考察等度及梯度系统。结果表明，各种流动相中以乙腈：0.1%三氟乙酸系统最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此选择此流动相系统作为样品HPLC检测的流动相。

4.3 色谱柱考察

选择不同填料、规格及厂家的色谱柱进行比较，包括Phenomenex LUNA C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）、Agilent Zorbax C18 Colum （250mm×4.6mm，5μm）。结果表明，各种色谱柱中以Phenomenex LUNA C18 Colum最佳，所得色谱图分离度良好，柱效较高，因此选择此色谱柱作为样品HPLC检测色谱柱。按本文的色谱条件对样品进行测定，样品均能与其他成分很好的分离，测得理论板数、分离度及对称因子，结果见表2。

4.4 其他

比较不同柱温与流速，柱温升高，分析时间缩短，峰型改善；流速低于1.0 ml.min-1分析时间延长，高于1.0 ml.min-1分析时间缩短。因此选择柱温40 ℃与流速1.0 ml.min-1。

综上所述，经过试验确定了CBS的HPLC分析方法，同时测定了3批次该原料药。上述方法准确、稳定，操作简单易于实施，可用于CBS的质量控制。

参考文献

[1] 许爱琴，孙玉文，冯全生，等.现代中医防辐射研究进展[J].现代中西医结合杂志，2010，19（30）：3361-3363.

[2] 杨镇州.抗辐射药物研究进展[J].重庆药学，2004，33（3）：467-469.

[3] Mihel BD，et al Mechims of DNA Damagese Repair.Academic， 1986： 325-328.

[4] Nenot JC.Radiation accidents over the last 60 years.Radiol Prot 2009， 29：301-320.

[5] 国家药典委员会.中国药典[M].第二部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[6] 姜建国，张西如，高燕霞，等.反相高效液相色谱法测定洛伐他汀有关物质.[J]药物分析杂志，2009，29（11）：1956-1960.