甲状腺癌miRNA-146与BRAF突变的相关性研究

姚廷敬，彭德峰，朱金海，朱正志，周 锐，马小开，崔 振，王岩岩

甲状腺癌(thyroidcarcinoma)是一种十分常见的内分泌腺恶性肿瘤，也是近年世界上发病率上升最快的恶性肿瘤之一，在北美与亚太地区已列入常见肿瘤的前10 位，但其作用机制仍不明了。细针穿刺细胞学活检是术前诊断甲状腺肿瘤的金标准，然而仍有20%～30%不能确定者，目前尚无理想的肿瘤标志物用于甲状腺癌诊断，因此探讨甲状腺癌的的早期诊断方案就具有重要的临床意义。miRNA 是上个世纪末发现的一种单链小分子RNA，在体内参与了一系列生理过程。miRNA-146 是最近发现的一种免疫调控因子，在自身免疫疾病进展中的作用已经成为研究热点，有望成为一种诊断的生物学标志物。此外，ARAF 癌基因是目前研究最多的具有特异性的甲状腺癌基因，其突变是甲状腺癌常见的基因突变。本研究对甲状腺癌中ARAF 突变与miRNA－146 表达相关性进行分析，希望为甲状腺癌诊断提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年4月～2012年4月我院收治的甲状腺癌患者30 例作为观察组，其中乳头状癌19 例、滤泡状癌6、未分化癌5 例，所有患者复符合甲状腺癌诊断标准［1］。将患者术中切下的肿瘤组织进行石蜡固定;选取正常甲状腺组织28 例作为对照组，2 组患者在年龄、性别构成等资料无显著性差异(P ＞0.05)，具有可比性，见表1。

表1 2 组人群一般资料比较(±s)

表1 2 组人群一般资料比较(±s)

组别例数性别男女平均年龄(岁)观察组30171342.37 ±7.63对照组28161241.72 ±8.59 t 值2.5721.1970.361 P 值＞0.05＞0.05＞0.05

1.2 实验方法 分以下几步进行:

1.2.1 免疫组化步骤［2］(1)石蜡切片脱蜡至水;(2)3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性;(3)蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min×3 次;(4)5%～10%正常山羊血清(PBS 稀释1:400)封闭，室温孵育10 min，倾去血清，再滴加AR 鼠单克隆抗体(PBS 稀释1:400)于切片上，37℃孵育1～2 h 或4℃过夜;(5)PBS 冲洗，5 min ×3 次;(6)滴加适量生物素标记二抗于切片标本上，37℃孵育10～30 min;(7)PBS 冲洗，5 min×3 次;(8)滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min;(9)PBS 冲洗，5 min×3 次;(10)将新配制的DAB 液滴加于切片上，显微镜下显色3～15 min;自来水充分冲洗，苏木紫复染，脱水，透明，封片。

1.2.2 查阅相关文献［3-4］设计引物，上游引物:5’-CTGGCATGTGAGCGCCTGCT-3’，下游引物:5’-CCACTTGGCTGTCCCGGCTG-3’;根据BRAF 常见在15 号外显子T1799 位置突变，将BRAF 第15 号外显子突变频率最高的序列进行扩增。用基因组DNA 作为模板，使用PCR 仪进行扩增;PCR 反应体系30 μl，其中ddH2O 17 μl，缓冲液10 ×buffer3 μl，dNTP5 μl，Taq 聚合酶0.1 U，DNA 模板0.5 μl，MgCl24.5 μl;扩增条件:95℃预变性10 min，90℃变性1 min，60℃退火1 min，70℃延伸1 min。35 个循环后，再72℃延伸10 min。将扩增产物用2%琼脂凝胶电泳，溴化乙锭染色，PCR 产物割胶回收。

1.2.3 电泳限制性酶切 PCR 产物15 μl，10 × buffer2 μl，NciI 内切酶2 μl，双蒸水6 μl，总反应体系25 μl。混匀后38℃过夜，琼脂凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。

1.2.4 DNA 测序 用凝胶与Marker 条带相近的样本进行扩增后测序，BRAF 测序结果与BRAF 基因组序列对比，确定是否突变及突变位点。

1.3 判断标准 每个切片选取5 个视野，取均值。按照着色深浅:0 分未着色，1 分着色较淡，2 分着色较深，3 分着色很深;按照着色范围:0 分阴性，1 分阳性细胞数低于20%，2 分阳性细胞数21%～60%，3 分阳性细胞数61%～75%，4 分阳性细胞数大于75%。采用阳性细胞显色范围与染色深浅相乘的方法进行评分，小于等于3 分为免疫反应阴性，大于3 分为阳性。

1.4 统计学方法 所有研究数据均采用SPSS17.0 统计学软件包进行统计分析，计量资料以±s表示，计量资料采用t 检验，P 值采用双侧检验。若P＜0.05 则表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA－146 在正常组织和甲状腺癌组织中的表达 免疫组化结果显示，30 例甲状腺癌组织中有27 例(90.0%)出现miRNA-146 表达阳性，而在正常组织中miRNA-146 表达为阴性，2 组染色评分均值分别为0.07 和7.34，二者差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 2 组miRNA-146 的表达(n，%)

2.2 BRAF 基因检测 通过BRAF 基因检测，发现在30 例甲状腺癌患者中，有17 例BRAF 基因突变，阳性率为51.0%，BRAF 突变在15 号外显子1 799 位点，为点突变，其中腺嘌呤替换为胞嘧啶(T1799A)。

2.3 甲状腺癌中BRAF 突变与miRNA－146 表达相关性 在甲状腺癌患者中，BRAF 突变阳性组miRNA-146 表达明显高于阴性组，miRNA-146 表达阳性率分别为94.1%(16/17)和76.9%(10/13)，miRNA-146 表达评分均值分别问9.51 和4.45，2 组相比，具有统计学差异(P＜0.05)，见表3。

表3 甲状腺癌中BRAF 突变与miRNA－146 表达关系(n，%)

3 讨论

甲状腺癌(thyroidcarcinoma)是一种十分常见的内分泌腺恶性肿瘤，也是近年世界上发病率上升最快的恶性肿瘤之一，在北美与亚太地区已列入常见肿瘤的前10 位，但其作用机制仍不明了［5］。细针穿刺细胞学活检是术前诊断甲状腺肿瘤的金标准，然而仍有20%～30%不能确定者，目前尚无理想的肿瘤标志物用于甲状腺癌诊断，因此探讨甲状腺癌的的早期诊断方案就具有重要的临床意义。

miRNA 是由Lee 等［6］1993年首先发现并在《Cell》上报道的一段由18～24 个核苷酸构的非编码的单链小分子RNA，其发现被美国《科学》杂志列为2002年世界十大科技突破之首。miRNA 普遍存在于动植物体内并参与了生命过程中的一系列重要进程，包括早期胚胎发育、细胞增殖、细胞分化以及在基因表达调控中的作用等。研究证实［7］，miRNA 在物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNA 在基因转录后水平上，通过与靶mRNA 互补结合，对基因的表达起负调节作用或基因沉默作用。miRNA 的发现使生物学许多领域都焕然一新。目前，已有大量的miRNA 被克隆，新的miRNA 又不断被发现。据推算［8］，人类基因组中有约1 000 多个miRNA 基因，单个miRNA 可调节200 多个靶基因，约三分之一的蛋白编码基因受miRNA 的调控。RNA-146 是最近发现的一种免疫调控因子，在自身免疫疾病进展中的作用已经成为研究人点，有望成为一种诊断的生物学标志物。

临床上，BRAF 基因突变常用预测预后不佳的基因标志物［9］，其与甲状腺癌的浸润、远处转移和复发有着密切联系。通过检测BRAF 基因突变可以对甲状腺癌活检进行辅助诊断，此外还可以进行筛选BRAF 抑制剂来进行靶向治疗［10］。本研究发现，甲状腺癌组织中，miRNA-146 表达阳性率为90.0%，而在正常组织中miRNA-146 表达为阴性，2 组染色评分均值分别为0.07 ±0.03 和7.33 ±0.01，这说明，miRNA-146是高敏感和特异性强的标志物，可以为甲状腺癌诊断提供依据;对miRNA-146 与BRAF 基因突变相关性进行研究后发现，miRNA-146 表达与BRAF 基因突变密切相关，我们推测BRAF突变可能是通过调控miRNA-146 进而对肿瘤细胞的代谢进行调节。

综上所述，在甲状腺癌中，miRNA-146 表达增加，且miRNA-146 表达与BRAF 基因突变密切相关。但是由于本研究样本数量较少，需要加大样本数，对具体的机理进行深入研究。

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